提高药用植物黄瑞香种子萌发率的研究(尚继云)

项目编号西北农林科技大学大学生创新创业训练计划项目创新训练项目申请书项目级别 校重点 项目名称 提高药用植物黄瑞香种子萌发率的研究 项目负责人 尚继云 学院、年级、专业 生命科学学院 生物工程103班 联系电话 电子邮件 填表日期 2012年4月8日 西北农林科技大学教务处制表一、基本情况项目名称提高药用植物黄瑞香种子萌发率的研究项目来源西北农林科技大学与甘肃久朝医药集团合作项目负 责 人尚继云性别女年龄21学号所在学院生命科学学院专业生物工程联系电话电子邮箱指导教师韩召奋性别女年龄37研究方向生物技术职称讲师联系电话电子邮箱项目成员姓名学号学院专业项目分工王妍坤生命科学学院生物技术实验设计及实验尚继云生命科学学院生物工程实验设计及实验陈旭东生命科学学院生物工程实验设计及实验项目组人员获奖及成果情况获奖者奖励、成果名称颁发单位及时间尚继云2011年国家奖学金国家教育部2011年11月30日尚继云校级三好学生西北农林科技大学2011年11月尚继云专业一等奖学金（两次）2010-2011年陈旭东专业二等奖学金(两次）2010-2011年二、立论依据1.项目的研究意义（限200字）黄瑞香(Daphne giraldiiNitsche)以其茎皮及根皮入药，俗称祖师麻，主具消炎镇痛的功效，并有抑制癌细胞活性的效果，是国家重点保护级中药材，具有很高的经济价值1-4。因其天然生境条件苛刻，导致生长缓慢。而其他生物及非生物性限制因素导致其种子败育、萌发率低5,6。长期连根式的过度采挖，严重破坏高原区域生态环境，限制中药产业发展。本项目通过对黄瑞香种子生理生化活性的研究，解决目前生产中黄瑞香种子萌发困难的问题，为其扩繁提供科学依据，为其大面积种子繁殖提供基础。2.国内外研究现状分析并附主要参考文献（限1000字）黄瑞香被收载于中国药典1997年版，属瑞香科植物。黄瑞香、陕甘瑞香、凹叶瑞香的干燥茎皮及根皮被称为祖师麻。具有祛风通络，散瘀止痛的功效，主治风湿痹痛，四肢麻木，头痛，胃痛，腰痛，跌打损伤。欧洲最早从16世纪初就有瑞香属植物用于治疗风湿病痛及缓解炎症的记载7-8。瑞士、新西兰、澳大利亚已经有6种瑞香属植物应用于疾病治疗。黄瑞香茎皮含大量纤维，可做造纸、人造棉行业原料使用，同时全株含有二萜类化合物，具有芳香气味，可试提芳香油，用于防治病虫害，由于其生长缓慢，适于园林造型、绿化，园林观赏植物，例如：DaphnemezereumL.等具有很高的经济价值。目前，祖师麻药材资源全部为野生资源，属于深根性灌木，其天然生境区分布于海拔1400米至1800米的高山稀数草甸区，自然生长较为缓慢。然而，连年大量连根式采挖，导致了高原区域极其脆弱的生态环境遭到破坏，生态重建也急需人工繁殖的黄瑞香种苗。掠夺式采挖也致使黄瑞香野生资源日渐匮乏，使市场原料供不应求，严重的制约了祖师麻中药企业的产业化生产，多数企业处于半停产状态。而利用植物的种子进行再生繁殖扩增，是一种简便有效且快速的方法。虽然国内外对黄瑞香药材的研究报道较多7-11，但是主要集中在黄瑞香药材化学成分的研究、质量控制研究、提取工艺研究、有效药用成份、药理活性研究等方面。黄瑞香种子生理活力的测定的研究目前尚无报道，尽管有人用黄瑞香种子切片来观察胚的败育，但仅限于研究的初级阶段，不够深入和系统 5，6,10。 本课题首次提出对濒危药用植物黄瑞香种子活力低进行研究，其最终研究成果可解决黄瑞香有性繁殖难和无性繁殖速度慢，繁殖率低的问题，并为进一步研究其育种和扩繁起到指导作用。同时针对性地解决目前生产实践中的实际问题，改善其资源不足、满足制药行业的迫切需要，将有利于极富民族特色的祖师麻系列相关产品的开发、利用及出口创汇，促进中药产业的良性发展。同时人工种植黄瑞香能够调整农村种植业结构，为农民增收提供新的途径8，对高原区域生态环境的保持与稳定也会发挥重要作用。主要参考文献：1 Indu BS., Bhesh Raj L. Local Communities in Nepal Himalaya-Towards Meeting International Standard of Sustainability on NTFPs Management. http:/iasc2008.glos.ac.uk/con ference %20papers/papers/S/Sapkota_131501.pdf 20082 Prasad R. Current status and management options of exotic and invasive weeds of forestry incoastal British Columbia, Canada. Outlooks in Pest Management（2005）16:225-229. 3 WaldemarS.,WieslawW., PawelK., JoannaJ.,AnnaW. NATURAL POTENTIAL OF THE SILESIAN BOTANICAL GARDEN IN CONSERVATION OF WILD PLANT AND CROP PLANT DIVERSITY. Bulletin of Botanical Gardens（2005）14:9-18.4 Rajesh S., Resource Assessment of Non-Timber Forest Products for Enterprise DevelopmentDolphin (P.G) Institute of Bio-Medical and Natural Sciences, Dehradun H.N.B. Garhwal University, Uttarakhand, India.(July, 2007)5 Wei Zh., Weidong Zh.，Tingzhao L.A New FlaVan from Daphne odora thunb var.atrocaulis RehdFitoterapia(2004)75:799800.6 Ji-Young Hong, Joo-Won Nam, Eun-Kyoung Seo and Sang Kook Lee,Daphnane Diterpene Esters with Anti-proliferative Activities against Human Lung Cancer Cells from Daphne genkwa.Chemical and Pharmaceutical Bulletin (2010)58:234-237. 7 Junsong Ch., Keming M., Bojie F., Laiye Q., XianLi X.,Yang L., Jianfei Zh., Distribution patterns of shrubby N-fixers and non-N fixers in an arid valley in Southwest China: implications for ecological restoration Ecol Res (2010)25:553-564.8 David Noshad Saber Miresmaili Andrew Riseman Abul Ekramoddoullah. vitro propagation of seven Daphne L. Plant call Tiss Organ Cult.(2009）96:201-209. 9 David N., Daphne Sudden Death Syndrome (DSDS):Pathogen Identification, Characteriz- ation and ScreeningFor Disease Resistance, (December 2007) A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTSFOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHYinTHE FACULTY OF GRADUATE STUDIES(Plant Science).10 Rye BL.,Pimelea: Thymelaeaceae. Flora of Australia(1990)18: 134211.11 Rye BL. An updated revision of Pimelea sect. Heterolaena (Thymelaeaceae) including two new taxa.Nuytsia(1999)13: 159192.12 Finn GJ., Creaven BS.,Egan DA. Daphnetin induced differentiation of human renalcarci- noma cells and itsmediationbyp mitogenactivated protein kinaseJ. Biochem Pharmacol, 2004, 67(9): 1779-1783.13 VanWyk BE. A broad review of commercially important southern African medicinal plants Journal of Ethnopharmacology 119(2008)342-355.三、研究方案1. 研究目标（限200字） 通过测定药用黄瑞香种子的多项活力指标，研究多种因素对种子活力的影响，分析找出种子活力低的原因，在此基础上，提出提高种子活力的方法，解决目前紧缺药材黄瑞香的种子繁殖困难的问题，为其扩繁提供进一步的科学依据。2.研究内容（限400字）2.1药用黄瑞香的种子的获取药用黄瑞香主要分布于陕西秦岭、甘肃祁连山、西藏唐古拉山，本项目实验材料由祖师麻生产企业甘肃久朝集团提供。2.2种子生理测定、生化测定 在实验室条件下模拟黄瑞香自然生长条件，并完成下面的测定： 2.2.1生理测定：发芽速率 幼苗生长势 抗逆性 呼吸水平 细胞渗漏物质 2.2.2生化测定：酶活性 能量代谢 贮藏物质代谢 2.3通过控制变量法，找出影响种子活力的本质因素 在控制变量的情况下，分别测定： 温度、湿度、光度、水分、氧气浓度、紫外线强度、机械损伤、种皮阻碍、微生物侵染、激素、次生代谢产物对种子活力的影响。2.4分析各个变量，通过实验验证，找出能提高种子活力的可行方法 记录各项数据并整合，设计实验得出影响其活力低的原因，提出能提高种子活力的可行的方法，通过实验验证，提出解决方案。3.拟解决的关键问题（限200字）3.1技术问题3.1.1种子呼吸水平测定，能量代谢测定，储藏物质代谢测定时需保证无菌操作，消除微生物呼吸消耗对其造成的影响。3.1.2避免多种因素对加速老化技术测定种子抗逆性实验结果准确性的影响。3.1.3熟练掌握四唑（TZ）法的操作技术。3.2科学问题3.2.1测定药用黄瑞香种子活力低的生理生化表现。3.2.2根据生理指标，设计实验、综合分析得出黄瑞香种子活力低的本质原因。4. 拟采取的研究方法及技术路线（限800字）种子活力测定萌发率繁殖利用生理测定生化测定发芽速率幼苗生长势抗逆性呼吸水平细胞渗漏物质酶活性能量代谢贮藏物质代谢对活力测定做总体评价影响活力的因素研究第一阶段温度湿度水分氧气浓度紫外线强度机械损伤种皮阻碍微生物侵染激素次生代谢产物分析处理数据得出阶段结论第二阶段根据以上数据设计实验得出导致其种子活力低的原因第三阶段提出解决方案通过对照实验验证以上方案得出最终结论第四阶段 5实验方案（限500字）5.1第一阶段 种子活力的测定5.1.1生理测定5.1.1.1预处理：打破种子休眠（方法：激素处理、低温处理、流水冲洗处理），干燥，用于后续试验。5.1.1.2测定种子发芽速率：常规发芽实验。测定指标：(1)首次记录(2)发芽系数 (A为逐日发芽量，t指与A相应之天数。）(3)活力指数（Iv=SGtDt 说明：S即干重，Gt为不同时间(t天)的发芽量，Dt为不同的发芽试验天数）5.1.1.3幼苗生长势测定：幼苗分级法5.1.1.4抗逆性测定：加速老化法和冷浸法5.1.1.5细胞渗透测定：电导法5.1.1.6呼吸水平测定：测定指标：P/O比值5.1.2生化测定5.1.2.1酶活性测定(1)四唑（TZ）法测定脱氢酶活性(2)光度法测异柠檬酸裂解酶(Isocitrate lyase, ICL)活性(3)淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶活力测定(4)细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase），过氧化氢酶（Catalase）和过氧化物酶（Peroxidase）活力测定5.1.2.2能量代谢：同生理测定中呼吸水平测定同时进行5.1.2.3贮藏物质代谢(1)酸价法(2)醛类物质定量测定法(3)蛋白质含量测定5.2第二阶段 种子活力影响因素5.2.1控制单一变量，探究温度、氧浓度、光照、紫外线强度对种子活力影响。5.2.2测定机械损伤，种皮阻碍，微生物对种子活力的影响。5.2.3测定内源激素对活力的影响。5.2.4测定种子次生代谢物对活力的影响。5.2.5记录统计并处理数据。5.3第三阶段 深入探究本质原因根据第二阶段得到的数据，深入分析种子活力低的原因。5.4第四阶段 提出解决方案针对种子活力低的本质原因，提出相应的解决办法，反复实验，检验方法的有效性和合理性，从而得出最完善的解决方案。6具备的知识基础（限150字）6.1 项目组成员已经完成植物学、植物生理学、生物化学的理论课程及相应实验操作方法的学习，并自学种子生理、种子工程等相关理论知识。6.2已经掌握植物组织培养相关技术，例如无菌操作等实验技能。6.3种子活力测定的方法。7.设备条件（限150字）本项目将依托建于本校的教育部森林培育重点实验室，生命学院农业部重点实验室的生物学平台实施，以上两个实验室可为项目的实施提供充备的试验场所及项目所需的大型仪器如：高效液相色谱仪、原子吸收光谱仪、激光共聚焦荧光显微镜、电子显微镜、高压灭菌锅、大型冷冻离心机、紫外、可见分光光度计、光照培养箱、人工气候箱和120m2程控温室及炼苗大棚等,能确保本项目顺利开展。8.本项目的创新之处（限200字）8.1对黄瑞香的研究主要集中于其药用机理方面，但对其种子萌发率低的研究很少。8.2首次对药用黄瑞香种子进行其种子活力的测定。8.3究其本质入手提出一套提高种子活力，解决种子萌发率低的方法。9. 项目研究年度计划2012年4月6月：获取种子材料，完成种子活力生理生化指标的测定，记录并处理数据。9月12月：分析以上数据，设计实验，分析各因素对种子活力的影响。2013年3月6月：依据前期实验结果，设计实验，找出影响种子活力低的根本原因。9月10月：针对以上原因，提出解决方案，通过对比试验对其进行验证，进一步完善，得出最终结论。10.项目成果 10.1建立黄瑞香种子活力数据体系。10.2确定导致黄瑞香种子活力低的原因。10.3针对种子活力低的原因，从各方面着手建立提高种子萌发率的方法体系。10.4在核心期刊上发表一到两篇论文或申请专利一项。四、经费预算支 出 科 目金 额（元）计 算 根 据 及 理 由合计30001.科研业务费500资料查询、项目研究结果发表的版面费等2.实验材料费2500实验药品，材料及耗材3其他支出无六、审批情况：指导教师对项目的评价及承诺： 该项目选题准确，针对目前生产中亟待解决的前沿性实际问题，具有较强的实际应用意义。项目撰写参考资料丰富，内容详实，论证合理，论据可靠。对提出的具体问题，针对性的提出解决方案或办法。实验内容全面，实验设计合理，可操作性强。实验结果可预期性强，对解决现实存在的问题具有实际应用价值。 本人将配合项目小组成员，及时有效的完成该项目。积极参与该项目的实施，督促该项目能够按进度计划顺利完成，取得预期的实验结果，有效解决目前制药企业的实际问题。为中药黄瑞香的繁殖提供有价值的科学实验结果。签字：年 月 日学院推荐意见： 分管领导签字： （公章）年 月 日学校评审组意见：建议项目经费： 元 组长签字： 年 月 日教务处意见：批准项目经费： 元 负责人签字： （公章） 年 月 日