发酵法生产 L 谷氨酰胺研究进展

发酵法生产 L 谷氨酰胺研究进展L-谷氨酰胺(L-glutamine, L-Gln)是 L-谷氨酸的 - 羧基酰胺化的一种条件性必需氨基酸(图 1),相对分子质 量 146.15,熔点 185(分解),晶体呈白色斜方或粉末 状,结晶状态下稳定,无臭,稍有甜味,溶于水( 水 溶液呈酸性) ,等电点 5 . 6 5 ,几乎不溶于乙醇和乙醚. L-Gln 属中性氨基酸,在偏酸,偏碱及较高温度下易分 解成谷氨酸或环化为吡咯烷酮二羧酸.O H 2N C CH2 CH2 N H 3+ CH COO-L-Gln是人体血液中浓度最高(500900 mol/L)的游 离氨基酸,所占比例高达 61%.L-Gln 在肾脏是肾小管 泌氨作用的主要氮源,在肝脏是糖异生和尿素合成的原 料,在神经组织又是神经递质的前体物质,在血液中 有暂时解除氨毒的作用,现已普遍认为 L - G l n 是一种 条件性必需氨基酸. L-Gln 主要生理功能如下: 治疗胃肠溃疡1.因外源 L-Gln 能促使胆汁分泌和 正常排粪,故 L-Gln 已用于临床治疗腹部溃疡,节段性 回肠炎和过敏性肠炎.如日本寿制药株式会社生产的 麦滋林 ,为 L - G l n / 萸磺酸钠颗粒剂,该胃药制剂 现已进入我国市场. 缓解运动综合症或运动疲劳2.L-Gln可以调节蛋白 质合成,抑制蛋白质降解,糖原合成,细胞生长,激 活免疫,提高生长激素水平.让成年人喝下一瓶含有 2g L-Gln 的饮料,90min 内,其血液样品中生长激素最 高可增长 4 3 0 % .目前已大量用于治疗运动员的运动综 合症和高强度劳动或运动后的疲劳恢复. 调节机体免疫力3-4.外源 L-Gln 会刺激免疫球蛋白 分 泌 ,促 进 免 疫 系 统 重 建 ,如 : 烧 伤 ,艾 滋 病 ,关 节炎等免疫系统的恢复. 增强脑神经机能5 .L-Gln 可被用作中枢神经抑制 剂,在大脑中被转化成谷氨酸,与葡萄糖一起参与脑 代谢,以平衡脑内电流脉冲,有利于人脑的清醒和情 绪稳定,是少数几种能克服血脑屏障和参与大脑化学反 应的物质之一,被称为大脑燃料 . L-Gln 在癌症治疗上的潜在价值6, 减少癌症治疗中 化疗和放疗的副作用. 1 L- 谷氨酰胺的生产方法 由于 L-Gln 重要的生理功能和临床治疗作用,如何 实现 L-Gln 的工业化生产越来越受到关注.L-Gln 的生产 方法主要有化学合成法,酶促合成法和发酵法. 1.1 化学合成法经 L-Gln 合成酶(GS)催化而成,如图 3 所示. 与化学合成法相比,酶促合成法反应步骤相对简 单,其中三磷酸腺苷( A T P ) 是必需的.A T P 价格昂贵, 同时酶促反应底物 NH 4 + ,副产品二磷酸腺苷(ADP)都明 显抑制 L-Gln 的生成,因此该生产方法不能满足大规模 工业化生产的需要. 1.3 发酵法 发酵法是目前最常用的 L-Gln 生产方法,具有原料来源广泛,生产成本低,产品质量可控,产物单一等 优点,适宜于大规模工业化生产.1 9 6 1 年,T s u n o d a 等 7 首先发现除了谷氨酸以外,在谷氨酸发酵液中还 有 L-Gln;1963 年,Oshima 等8 通过改变谷氨酸微球菌 的发酵条件使谷氨酸发酵转向 L-Gln 发酵;七十年代, Nakanishi 等9-11进一步证实了,改变发酵条件可以使谷 氨酸产生菌从谷氨酸发酵转向 L - G l n 发酵.八十年代 后,我国在实验室小试或中试规模中进行了 L-Gln 发酵 法生产,但是 L-Gln 产量低12-13 ,至今未能进行大规模 工业化生产. 本文对发酵法生产 L-Gln 的关键技术环节(如菌种选 育,发酵工艺和分离纯化) 的研究进展进行综述,并详 细阐述L-Gln生物合成代谢调控和新型过滤及其藕联技术 在下游分离纯化过程中的应用. 2 2.1 发酵法生产 L- 谷氨酰胺 菌种选育 L-Gln 生产菌种主要来自谷氨酸生产菌,如棒杆菌C H 3O H CS2 NH3 C 5 H 9 NO 4 (Glu) C 6 H 11 NO 4 C 7 H 20 N 4 O 4 S 2 H 2S O 4 NH3 HOAC C 7 H 18 N 4O 3 S 2 C 5 H 10 N 2 O 3 (L-Gln) C H 3O H N H 2N H 2 Raney 镍 C 5 H 9 NO 4 (Glu) C 6 H 11 NO 4 C 6 H 13 N 3 O 3 H 2S O 4 C6H 10 N2O 3(L-Gln) 图 2 化学法合成 L-Gln 流程图 Fig.2 Chemical synthetic pathway for production of L -Gln(Corynebacterium sp.)9-11, 短杆菌(Brevibacterium sp.) 7,14 ,微球菌(Micrococcus sp.)8.此外,还有非谷氨 酸生产菌, 如产黄菌(Flavobacterium rigense)的一些变 15-18 异菌种 . 目前,L-Gln 生产菌种的选育主要采用传统的随机 诱变结合定向筛选的方法,随机诱变包括化学诱变,物 理诱变和物理化学复合诱变等,常用的诱变剂和诱变因 素有硫酸二乙酯,亚硝基胍,- 射线,紫外线等; 定向筛选包括对氨基苯甲酸的结构类似物磺胺胍的抗性 突变筛选,L-Gln 结构类似物抗性突变筛选,高 NH 4 + 浓 度抗性突变筛选等.此外,随着人们对 L-Gln 生产菌株 遗传特性的研究,通过基因工程的手段改造生产菌种提 高 L-Gln 的生产能力,有可能从根本上解决 L-Gln 生产能 力低的难题. Y a m a d a 等 1 6 , 1 8 以非谷氨酸生产菌产黄菌属 (Flavobacterium rigense)FERM-P no. 3556为起始菌种, 通过紫外诱变获得了一株青霉素抗性突变株 FERM-P no. 3628,L-Gln 生产能力由 10g/L 提高到 25g/L. 湖北工业大学吴思方等19,24采用- 射线 - 硫酸二乙 酯 - 射线进行复合诱变,磺胺胍抗性筛选得到一株高产主要有如图 2 所示两种化学合成法生产 L-Gln: 由化学合成法流程图可见,两种方法均采用浓硫酸 作为必需的催化剂,反应条件苛刻,反应步骤多,收 率低.第二种方法虽有所改进,但仍很复杂,且要求 使用催化剂 Raney 镍,对工艺条件提出了新的要求.化 学合成法使用的化学试剂在产品中会有不同程度的残 留,L-Gln 作为一种药或功能食品,对纯度有较高的要 求,而且大量化学试剂的使用会造成环境污染,从而 限制了产品质量及使用范围. 1.2 酶促合成法 酶促合成法生产 L-Gln 是以 NH 4 + 及谷氨酸作原料,Glu + NH4+ + ATP GS L-Gln + ADP + Pi +H2O图 3 酶法合成 L-Gln 流程图 Fig.3 L -Gln produced by enzyme catalysis专题论述食 科 品 学2008, Vol. 29, No. 03501菌株 SH77,L-Gln 平均生产能力由 8.2g/L 提高到 55.3g/L. 孙智杰等 在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum) ATCC 1 4 0 6 7 中 表 达增 强 摄 氧 的 透 明 颤 菌 血 红 蛋白基因20Gln 合成需要过量铵之间的矛盾,在谷氨酸棒杆菌突变 株 NS61 中利用 GS 酶的表达特性,设计了在线氮饥饿处 理的发酵过程;在限制初始氮源浓度的条件下,菌体在 生长后期自然进入氮饥饿状态,G S 酶表达量增加,此 后再提供充足的铵盐,提高 L-Gln 的合成能力,结果使 L-Gln 的产量提高了 69%,达到 11.5g/L,菌体内谷氨酰 胺合成酶活性提高了 2 倍以上.李春等26提出了原位氮 饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略,提高了谷氨酰胺的 产量,最高产量可达 2.19%,比原位氮饥饿工艺提高了 近 72%,比未经过氮饥饿处理的旧工艺提高了近 200%, 达到 19.7g/L. 2.3 生物合成代谢调控GDH Glu + H2O + NADP +(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb),以此提高细胞 的摄氧能力及能量的供给水平,结果在溶氧浓度只有 5% 的条件下,重组菌比野生菌细胞干重提高了 1.2 倍, 达到了 54.1g/L,谷氨酸的生产能力提高了 6.5 倍,达到了 9.56g/L, L-Gln的生产能力提高了1.4倍, 达到了5.51g/L. U s d i n 等 2 1 从丙酮丁醇梭杆菌( C l o s t r i d i u m acetobutylicum)P262中克隆L-Gln合成酶的编码基因, 构 建 pHZ200 重组质粒,导入 E.coli ET8051 中进行克隆表 达,并研究了 L-Gln 合成酶的表达调控,结果发现 L-Gln 合成酶不受腺嘌呤共价修饰调控,重组菌的生长速度是 野生菌的 1 . 7 倍;Y a m a m o t o 等 2 2 从腐臭假单胞菌 (Pseudomonas taetrolens)中克隆谷氨酰胺合成酶基因Y- 3 0 ,导入大肠杆菌中进行克隆表达,其表达量是 Pseudomonas taetrolens 中的 30 倍.上述基础工作,为 构建工程菌大规模工业化生产 L-Gln 奠定了一定基础. 2.2 2.2.1 发酵工艺 培养基 Nabe 等16 研究了 NH 4 + 浓度和延胡索酸对产黄菌属 (Flavobacterium rigense)生产L-Gln的影响, 结果发现 延胡索酸是 L - G l n 生产的关键影响因子;高浓度 N H 4+ +2-oxoglutarate + NH4+ + NADPH + H+ Glu + NH4+ + ATP GSL-Gln + ADP + P i + H2O GDH 2Glu + NADP +L-Gln + 2-oxoglutarate + NADPH + H +图 4 L-Gln 发酵生产相关的生物反应及其关键酶 Fig.4 Related reaction and key enzyme for production of L-GlnL-Gln 生物合成是以谷氨酸(glutamate)和 NH4 + 为底 物, 在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的催 化下合成的.L-Gln 生物合成在细胞内是一个动态平衡 的过程,除了受到谷氨酰胺合成酶(GS)调控外,还受到 谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH),谷氨 酸合酶(glutamate synthase, GOGAT)的调控(图4)27. 因 此,代谢调控生物合成 L-Gln,须建立一套协同调控策 略,促进谷氨酰胺合成酶( G S ) 活性,抑制谷氨酸合酶 (GOGAT) 活性,抑制 L - G l n 的降解,从而过量合成 L - Gln. 2.3.1 生物合成途径中关键酶的调控 Tesch 等 2 8 在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中研究了 N H 4 + 浓度对 G D H,GS,G O G A T 活性的影响,结果发现 N H 4 + 浓度从 1 m m o l / L 增加至 90mmol/L 时,GDH 活性维持在 1.3U/mg 蛋白,没有发 生变化,但当 NH4+ 浓度大于 10mmol/L 时,GS,GOGAT 活性小于 1mmol/L 的 10%,即分别低于 110U/mg 蛋白, 4 2 U / m g 蛋白;并且发现谷氨酸脱氢酶酶促反应是谷氨 酸棒杆菌摄取 N H 4 + 的第一步反应.此研究结果为梯度 补氮生产 L-Gln 提供了理论基础. S c h u l z 等 2 9 考察了碳源和氮源对谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032 中 GS 和 G O G A T 活性的影响,结果发现在碳源充足,氮源缺乏 的条件下,G S 和 G O G A T 活性分别提高了 5 倍和 7 倍; 在碳源和氮源都缺乏的情况下 G S 活性下降了 3 倍,(0.9%1.6%)有利于 L-Gln 的生产,但是当 NH4+ 浓度大 于 1.8% 时又会抑制 L-Gln 的生产;最终得出当 NH 4 浓 度为 0.9%1.6%,延胡索酸浓度为 5.5% 时,L-Gln 生 物合成达到最大值 25g/L. A n d e r s o n 等 2 3 考察了 N a C l 对金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)生产 L-Gln 的影响,结果发现 添加 5.8% 的 NaCl ,L - G l n 的含量提高了 2 8 0 0 %,达 到 161.82nmol/mg 干细胞;添加 10% NaCl,L-Gln 的含 量提高了 3400%,达到 195.71nmol/mg 干细胞. 湖北工业大学吴思方等24 研究了氮源种类和浓度, 金属离子,CaCO 3 等对 L-Gln 生产的影响,得出最佳发 酵培养基为:葡萄糖 1 6 % ,氯化铵 4 % ,玉米浆 0 . 5 % , 磷酸氢二钾 0.05%,磷酸二氢钾 0.05%,硫酸镁 0.05%, 尿素 1.4%,硫酸亚铁 0.5mg/100ml,硫酸锰 2.5mg/100ml, 硫酸锌 0.5mg/100ml, 1 0.1mg/100ml, VB 结果使菌株SH77 的 L-Gln 生产能力平均达 53.0g/L,最高达 56.2g/L,这 是目前文献报道的最高产量. 2.2.2 发酵控制方式 因为L-Gln生物合成是在谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)催化下进行的,所以发酵法生产 L-Gln 的关键在于调控 G S 酶活性微生物发酵法是 L-Gln 的主要生产方法,生产国主 要是日本,韩国也有少量生产.1 9 7 7 年日本用发酵法 生产 L-Gln 的年产量达 100t,1979 年上升到 500t,1990 年则上升到 1200t,并有逐年递增的趋势.全世界 L-Gln 生产量逐年递增,在 1986 年为 900t,1990 年为 1800t, 目前年产量约为10000t. 我国已有不少企业研究L-Gln发 酵生产工艺,但只是在实验室小试或中试规模中生产 L- Gln.由于发酵法生产 L-Gln 国外仅日本等几个国家生 产,所以国际市场对我国 L-Gln 出口需求迫切,预计年 出口量将迅速达到 1000t. 对于我们这样一个 13 亿人口的大国,L-Gln 等药用 氨基酸需求量很大,有巨大的潜在市场,目前我国药 用 L-Gln 依靠进口且价格昂贵.预计国内 L-Gln 需求可达 5000 吨 / 年,现在国际市场上 L-Gln 价格大约 100 万元左 右 / 吨,L-Gln 的生产成本大约为谷氨酸的 34 倍,产 值达到 50 亿人民币,利税可达到 1 亿元人民币.因此, 发酵法大规模生产 L-Gln 将满足国内的市场需求,推动 我国氨基酸发酵工业的发展,同时,产品还可出口创 汇进入国际市场分离纯化 L-Gln 发酵过程中的主要副产物是谷氨酸,而 L-Gln和谷氨酸两者分子结构和化学性质相近,分离困难,并 且 L-Gln 不稳定,分离过程中在酸性条件下容易转化成 谷氨酸.国外 80 年代报道 L-Gln 提取收率为 3 0 %,近 来有专利报道实验室提取收率达 70% 以上 3 1 . 2.4.1 L-Gln经典提取方法 L-Gln 经典提取方法有浓缩结晶法,冰析法和双柱法(阴阳离子交换树脂组合法).用离子交换法分离提取 L- Gln,可将发酵液调至酸性,在酸性条件下使 L-Gln 成为 阳离子,用强酸性阳离子交换树脂吸附;也可将发酵液 调至中性附近,使其成为阴离子,用强碱性阴离子交换 树脂进行交换吸附;还可以将阳离子和阴离子交替使用. 2.4.2 L-Gln 分离纯化的最新进展 新型过滤技术,过滤与离子交换耦联技术及相关设为提高发酵法生产 L-Gln 产量,国内外学者进行了 大量研究工作:吴思方等28 采用随机诱变定向筛选的育 种技术,并对发酵工艺进行了优化,使 L-Gln 产量达到 5 6 . 2 g / L ,这是目前文献报道 L - G l n 产量的最高值; Wakisaka26对L-Gln生物合成特性及其调控机制进行了深 入研究,建立了相关的耦联发酵策略,使 L-Gln 生物合备的开发应用,使 L-Gln 分离提取收率,纯度得到了大 幅度提高,并最终分离纯化出了符合药用标准的 L-Gln.