磁珠提取DNA原理(2)

磁珠提取DM原理磁珠纯化DNA原理1、DNA与磁珠作用原理分选磁珠的作用原理就是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化 方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及盐离子等，在一 定浓度的PEG与盐离子环境中，DNA可吸附到竣基修饰的高分子磁珠表面(即固 相载体)，该过程就是可逆的，在适当条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。纳米级别的磁珠表面性质不同，分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状 材料组成并无太大差异，基础结构一般分为3层,最内层的核心就是聚苯乙烯、第 二层包裹磁性物质一四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面就是竣基(-COOH)修饰 的高分子材料所构成，其中竣基行使与核酸结合的工作。/JK率乙磁在整个体系中，PEG就是影响DNA回收的决定性因素(其她因素还包括DNA 大小与浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA在一定浓度的PEG存在条件 T, NaCI或MgCb促进条件下，使DNA发生脱水反应，分子构象会发生急剧变化, 山线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，同时随PEG分子量、浓度以及盐浓 度的不同，不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中，特定分子 量的PEG的功能主要就是与盐离子共同作用，改变不同长度DNA的分子构象，同 时增加体系的粘稠程度，使磁珠存在其中处于悬浮状态，不易沉降,增加磁珠在空 间位置的碰撞与排斥，从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果，除此之外,PEG与 蛋白质具有相容性厂也可去除样品中的蛋白质。当处于PEG与盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后，会 暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团，与表面带负电荷的竣基磁珠结合, 但如何解释负负电荷之间的作用川 前还不得而知。但普遍认为，这就是山于带正磁珠提取DM原理电荷的盐离子的作用（如N）带负电的磷酸基团借山解离的盐离子（如Na+）与 竣基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到竣基磁珠表面。当PEG与盐类被去除 之后,加入水性分子，会快速充分水化DNA,解除其三者之间的离子相互作用，使 得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。COOMMaCI/PEODNACOO-CanonNap岂 o磁珠的出现，使得核酸制备的实验可以实现自动化，同时相较于传统的回收 方式,还具有3个明显的优势：1）效率更高，以DNA为例，ipL磁珠的承载量可达 7pg；2）避免使用有机溶剂，如酚类、氯仿等等，更加安全;3）操作简单，无需离心, 也更有利于保留核酸的完整性。2、蛋白酶K的作用蛋口酶K具有降解蛋白的功能，而细胞膜主要就是山蛋口质构成的富有弹性 的半透性膜，因此蛋白酶K能够裂解细胞，从而DNA能够释放出来。3、无水乙醇沉淀DNA用无水乙醇沉淀DA,这就是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点 就是可以任意比与水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因 此就是理想的沉淀剂。当加入乙醇时，乙醇会夺去DM周围的水分子，使DNA失水 而易于聚合。4、TE缓冲液溶解DNA采用Tris-HCl（pKa=8sO）的缓冲系统山于缓冲液就是TrisH+/Tris,不存在 金属离子的干扰作用4攵在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCl系统并且TE 缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。5、为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产 生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能 减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相，中层 变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。