高中生物：第5章 植物的组织培养 课件（1）（中图版选修1）

第第5章章 植物的组织植物的组织培养培养实验目的：实验目的：1.掌握植物组织培养基掌握植物组织培养基(MS)的配制的配制(Murashige and Skoog)植物组织培养基的配制植物组织培养基的配制烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立实验用品：实验用品：1.仪器和用品：仪器和用品：500 ml试剂瓶试剂瓶1个；个；100 ml试剂瓶试剂瓶5个；个； 250 ml试剂瓶试剂瓶4个；高压灭菌锅；电子天平；个；高压灭菌锅；电子天平；烧杯（大、中、小各烧杯（大、中、小各2个）、玻璃棒、移液管、个）、玻璃棒、移液管、搪瓷缸、培养瓶、电炉、搪瓷缸、培养瓶、电炉、pH计或精密计或精密pH试纸、试纸、容量瓶（大、中、小各容量瓶（大、中、小各1个）个）2.化学药品及试剂化学药品及试剂 汉语名汉语名 分子式分子式 生产公司生产公司 分子量分子量 纯度纯度 硝酸铵硝酸铵 NH4NO3 上海通亚精细化工厂上海通亚精细化工厂 80.04 分析纯分析纯 磷酸二氢钾磷酸二氢钾 KH2PO4 中国江苏南京中山集团公司化工厂中国江苏南京中山集团公司化工厂 136.09 硝酸钾硝酸钾 KNO3 上海鑫达精细化工有限公司上海鑫达精细化工有限公司 101.10 硫酸镁硫酸镁 MgSO4.7H2O 山东省化工研究院山东省化工研究院 246.47 氯化钙氯化钙 CaCl2.2H2O (上海上海)四联化工厂四联化工厂 147.03 硫酸锰硫酸锰 MnSO4.4H2O 上海试剂工厂上海试剂工厂 169.02 硫酸锌硫酸锌 ZnSO4.7H2O 山东潍坊市试剂厂山东潍坊市试剂厂 287.54 硼酸硼酸 H3BO3 济南化学试剂厂济南化学试剂厂 61.83 碘化钾碘化钾 KI 上海化学采购站上海化学采购站 166.064 钼酸钠钼酸钠 Na2MoO4.2H2O 北京五十六北京五十六0一化工厂一化工厂 241.95 分析纯分析纯 氯化钙氯化钙 CaCl2.6H2O 济南试剂总厂济南试剂总厂 237.93 五水硫酸铜五水硫酸铜 CuSO4.5H2O 济南化学试剂厂济南化学试剂厂 249.68 汉语名汉语名 分子式分子式 生产公司生产公司 分子量分子量 纯度纯度 乙二胺四乙酸钠乙二胺四乙酸钠 Na2-EDTA.2H2O 济南试剂总厂济南试剂总厂 372.24 分析纯分析纯 硫酸亚铁硫酸亚铁 FeSO4.7H2O 山东博山化学试剂厂山东博山化学试剂厂 278.01 分析纯分析纯 甘氨酸甘氨酸 C2H5NO2 中国科学院上海生物化学研究所中国科学院上海生物化学研究所 75.07 分析纯分析纯 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl 中国医药上海化学试剂站中国医药上海化学试剂站 205.64 盐酸硫胺素盐酸硫胺素 C12H17ClH4OS.HCl 中国新兴化工试剂研究所中国新兴化工试剂研究所 337.27 烟酸烟酸 C6H5NO2 北京芳草医药化工研制公司北京芳草医药化工研制公司 123.11 化学纯化学纯 肌醇肌醇 C6H12O6 中国政翔化学试剂研究所中国政翔化学试剂研究所 180.16 3-吲哚乙酸吲哚乙酸IAA（b-Indoleacetic acid） 天津天泰精细化工品有限公司天津天泰精细化工品有限公司 125.1 分析纯分析纯 萘乙酸萘乙酸 NAA C12H10O2 中国医药上海化学试剂公司中国医药上海化学试剂公司 186.21 化学纯化学纯叶酸叶酸 C19H19O6N7 上海化学试剂厂上海化学试剂厂 441.42 2,4-D （2,4-dichlorophenoxyacetic acid ）上海雪满生物科技有限公司）上海雪满生物科技有限公司 6-BA（N6-benzylaminopurine） 上海伯奥生物科技有限公司上海伯奥生物科技有限公司 225.25 蔗糖蔗糖 sucrose 天津市广成化学试剂有限公司天津市广成化学试剂有限公司 342.29 分析纯分析纯 琼脂琼脂 Agar 国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司 B.RMS培养基配制表培养基配制表 MS母液配制用量母液配制用量g.L-1每升培养基取用量每升培养基取用量mL/L大量元素大量元素(20倍倍)KNO338 NH4NO33350MgSO47H2O7.4KH2PO43.4CaCl2 H2O8.8微量元素微量元素(200倍倍)MnSO4 4H2O4.465ZnSO47H2O1.72H3BO31.24KI0.166NaMoO42 H2O O0.05CuSO45 5H2O0.005CoCl6 6H2O0.005铁盐铁盐Na2-EDTA2 H2O O7.465FeSO47H2O5.56有机附加物有机附加物(200倍倍)甘氨酸甘氨酸(氨基乙酸氨基乙酸)0.25VB60.05VB10.01烟酸烟酸0.05肌醇肌醇0.01生长素类生长素类 在组培中的作用：诱导细胞的分裂和根的分化。在组培中的作用：诱导细胞的分裂和根的分化。 常用种类及作用：常用种类及作用：IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)、 NAA、 IBA、NOA（萘氧乙酸）、（萘氧乙酸）、 2.4D、 2.4.5T（三氯苯（三氯苯氧乙酸）氧乙酸） 使用时先配成母液，母液的浓度一般为使用时先配成母液，母液的浓度一般为0.1 mg/ml或或1 mg/ml；配时一般先将其粉末溶于；配时一般先将其粉末溶于95乙醇乙醇或或0.1 mol/L的的NaOH中，再定容。中，再定容。细胞分裂素类细胞分裂素类 在组培中的作用：促进细胞分裂和由在组培中的作用：促进细胞分裂和由callus或器官上或器官上分化不定芽。分化不定芽。 常用种类及作用：常用种类及作用：BAP（苄氨基嘌呤）、（苄氨基嘌呤）、6BA（苄（苄基腺嘌呤），基腺嘌呤），zip（异戊烯氨（异戊烯氨 基嘌呤）和基嘌呤）和KN（激动素）（激动素） 使用时先配成母液，母液的浓度一般为使用时先配成母液，母液的浓度一般为0.1 mg/ml或或 1 mg/ml；配时一般溶于；配时一般溶于0.5或或1 mol/L的的HCl或稀薄或稀薄的的NaOH中，再定容。中，再定容。实验步骤：实验步骤：1.母液的配制：母液的配制： 见见MS培养基配制表培养基配制表2.培养基的配制：培养基的配制：1）称取一定量的蔗糖，溶解于适量蒸馏水中（不能太）称取一定量的蔗糖，溶解于适量蒸馏水中（不能太多），倒入多），倒入500ml容量瓶中。容量瓶中。2）吸取各种母液（吸取量根据培养基的最终体积决）吸取各种母液（吸取量根据培养基的最终体积决定），加入到上述容量瓶中。定），加入到上述容量瓶中。3）吸取各种激素（所配制的培养基是：）吸取各种激素（所配制的培养基是：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L ），加入到上述容量瓶中。），加入到上述容量瓶中。4) 定容到定容到500 ml。5）将上述溶液调）将上述溶液调pH值到值到5.8-6.0。6) 将上述溶液加入琼脂后，于电炉上煮沸。将上述溶液加入琼脂后，于电炉上煮沸。7）将上述培养基冷却至）将上述培养基冷却至40-50 摄氏度后，将其分装到摄氏度后，将其分装到100 ml三角瓶中。三角瓶中。8）将三角瓶用封口膜封口。并对不同的培养基做好标）将三角瓶用封口膜封口。并对不同的培养基做好标记。记。3.灭菌：灭菌： 通常培养基应在汽相通常培养基应在汽相121摄氏度的条件下在摄氏度的条件下在高压灭菌锅内灭菌高压灭菌锅内灭菌20 min。 在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针上升到上升到0.05 Mpa时，放一次气，然后在温度达时，放一次气，然后在温度达121摄氏度时，保持此压力灭菌摄氏度时，保持此压力灭菌15-20 min。灭。灭菌完成后，待灭菌锅的压力降到菌完成后，待灭菌锅的压力降到0时，打开灭菌时，打开灭菌锅，取出培养基，放平，待培养基凝固后备用。锅，取出培养基，放平，待培养基凝固后备用。注意事项：注意事项：1.实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。2.用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将其放在小烧杯中称量。药品，应将其放在小烧杯中称量。3.各种母液应保存在各种母液应保存在2-4摄氏度的冰箱中，以免变质、长霉。摄氏度的冰箱中，以免变质、长霉。4.用高压灭菌锅时，一定要先检查一下其中的水是否合适。用高压灭菌锅时，一定要先检查一下其中的水是否合适。接种：接种： 在无菌的条件下，取烟草无菌苗的叶片，剪成（在无菌的条件下，取烟草无菌苗的叶片，剪成（0.51cm）*(0.51cm)大小的小块，接种于诱导培养基大小的小块，接种于诱导培养基MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L中诱导愈伤组织，在此培养基上能中诱导愈伤组织，在此培养基上能诱导出愈伤组织并能够诱导出不定芽。诱导出愈伤组织并能够诱导出不定芽。不定芽生根：不定芽生根： 将在愈伤组织中生成的不定芽移栽到将在愈伤组织中生成的不定芽移栽到1/2 MS培养基中，其培养基中，其目的是诱导不定芽生根，使其发育成烟草小植株。目的是诱导不定芽生根，使其发育成烟草小植株。 植物材料灭菌的常用药品和原理植物材料灭菌的常用药品和原理1.乙醇：乙醇： 原理：脱水作用和溶脂性，从而使原理：脱水作用和溶脂性，从而使Protein脱水、变脱水、变性、沉淀及质膜破损、透性增加，使微生物致死。性、沉淀及质膜破损、透性增加，使微生物致死。 使用浓度：使用浓度：70（V/V） 灭菌时间：灭菌时间：560 s2.次氯酸盐：次氯酸盐： 原理：在水中形成次亚氯酸（原理：在水中形成次亚氯酸（HClO），），HClO分解分解后形成盐酸和新生态氧后形成盐酸和新生态氧（ HClOHCl+O-），）， O-具有很强的具有很强的 氧化性而具有杀菌作用。氧化性而具有杀菌作用。 使用浓度：使用浓度：0.52.5的有效氯的有效氯 灭菌时间：灭菌时间：515 min3.升汞（升汞（HgCl2）：）：原理：汞离子可与带负电荷的蛋白质结合，使菌原理：汞离子可与带负电荷的蛋白质结合，使菌体蛋白变性，酶失活。其杀菌效力极强。体蛋白变性，酶失活。其杀菌效力极强。 使用浓度：使用浓度：0.1-0.2（W/V）灭菌时间：灭菌时间：10 min4.新洁尔灭：新洁尔灭：原理：广谱表面活性灭菌剂。原理：广谱表面活性灭菌剂。 使用浓度：使用浓度：1：200（V/V）灭菌时间：灭菌时间：30 min或更长或更长 接种第一天接种第一天 接种第二天，因为外植体细胞开始被诱导脱分化，接种第二天，因为外植体细胞开始被诱导脱分化，并不断分裂增殖，造成叶片中央与边缘的细胞分并不断分裂增殖，造成叶片中央与边缘的细胞分裂不均匀，因此，叶片中央凸起。裂不均匀，因此，叶片中央凸起。接种第五天，脱分化细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织，接种第五天，脱分化细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织，表现为叶片边缘泛黄增厚，叶片中央进一步凸起。表现为叶片边缘泛黄增厚，叶片中央进一步凸起。接种第九天，脱分化细胞不断增值，愈伤组织接种第九天，脱分化细胞不断增值，愈伤组织不断增厚，整个叶片都翘起，并且已经开始再不断增厚，整个叶片都翘起，并且已经开始再分化形成绿色生长点。分化形成绿色生长点。第九天（诱导生成愈伤组织）第九天（诱导生成愈伤组织） 接种第十九天，绿色生长点进一步发育形成了不定芽，接种第十九天，绿色生长点进一步发育形成了不定芽，不定芽长度最长可达不定芽长度最长可达1 cm 。 第十九天（长出幼叶）第十九天（长出幼叶） 将不定芽在无菌条件下，从芽的基部切下，然后插入生根培养基将不定芽在无菌条件下，从芽的基部切下，然后插入生根培养基中（中（1/2 MS），诱导生根。），诱导生根。 芽的生根情况芽的生根情况