分光光度法测定苹果果实总黄酮含量的条件优化

分光光度法测定苹果果实总黄酮含量的条件优化文献标识码：A类黄酮是一类多酚化合物，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗过敏、扩张血管等生理功能。苹果果实富含类黄酮，Tsao等对8个苹果品种进行了测定，类黄酮含量在834.22300.3mg?kg-1（果皮）和15605.6mg?kg-1。（果肉）。类黄酮测定方法是研究苹果果实类黄酮组成与含量的基础。苹果果实类黄酮的测定通常采用液相色谱法，类黄酮经色谱柱分离后，用相应的标准品进行定性和定量。但液相色谱法并不适于苹果果实总黄酮含量的测定。究其原因，苹果果实中已报道的类黄酮超过30种，而多数类黄酮没有标准品。目前，苹果果实总黄酮含量测定报道甚少，均采用分光光度法，以硝酸铝为显色剂，以芦丁为标准品，检测波长为500nm或510nm然而，笔者试验显示，该方法用于苹果果实总黄酮含量测定存在较多缺陷，检测条件有待系统研究。为此，对标准品种类、显色剂种类、检测波长、环境温度、显色反应体系中乙醇浓度等进行了筛选和优化，旨在确定分光光度法测定苹果果实总黄酮含量的适宜条件。1 材料和方法1.1 材料供试材料为富士、红星、金冠和国光苹果果实。购自水果超市。1.2 方法1.2.1 样液制备称取苹果果肉200g,加入100mL8盛乙醇，匀浆3min。称取15g样品，加入30mL8赢乙醇，漩涡混匀0.5min，放置3h，超声提取30rain，抽滤，滤渣再超声提取2次（每次加20mL80%乙醇），合并滤液，用80%乙醇定容至100mL得果肉样液。削取苹果果皮（厚约1mm）冻干，粉碎。称取1g样品，加入30mL80乙醇，以下操作同“果肉样液的制备”，得果皮样液。1.2.2 总黄酮含量测定吸取1mL样液或标准溶液于10mL容量瓶中，加入5mL蒸储水和0.3mL5%亚硝酸钠溶液，摇匀，加人0.3mL10%铝盐溶液，摇匀，放置5min,加入2mL1mol?L-1氢氧化钠溶液，摇匀，蒸储水定容，测定500nm吸光度（A500）。样品总黄酮含量以鲜质量计。1.2.3 测定条件筛选与优化分别吸取儿茶素、芦丁、槲皮素和根皮苷溶液（200mg?L-1），以氯化铝为显色剂，按1.2.2操作，定容后进行200700mn长扫描，确定适宜标准品。吸取1mL200mg?L-1儿茶素溶液或样液，分别以氯化铝、硝酸铝和硫酸铝为显色剂，按1.2.2操作，定容后进行200-700nm波长扫描，确定适宜显色剂。吸取1mL200mg?L-1儿茶素溶液或样液，以氯化铝为显色剂，按1.2.2操作，定容后在4、25或40环境温度下放置2h（其间。每隔20min测定1次A500），确定适宜环境温度。反应体系设8和502种乙醇浓度，以氯化铝为显色剂，按1.2.2操作（乙醇浓度为50%时，将“加入5mL蒸储水”改为“加入4.2mL无水乙醇”），确定反应体系适宜乙醇浓度。以空样品池为参比，分别对试剂空白、样液和显色后样液进行400600nm波长扫描。分析背景成分对测定结果的影响。1.2.4 方法学考察用80乙醇配制50、100、150、200、250和300mg?L-1儿茶素溶液，以氯化铝为显色剂，按1.2.2操作，测定A500,绘制标准曲线，确定适宜浓度范围。分别用果肉和果皮制备样液，以氯化铝为显色剂，测定总黄酮含量，计算相对标准偏差，考察方法精密度。分别在果皮和果肉中添加一定量的儿茶素，制备样液，以氯化铝为显色剂，测定总黄酮含量，计算添加回收率，考察方法准确度。2 结果与分析2.1 标准品的筛选儿茶素、芦丁、槲皮素、根皮苷等4种类黄酮标准品溶液显色后进行波长扫描，结果见图1。在紫外光谱区，除槲皮素和根皮苷的第2个吸收峰外。其余吸收峰均过于尖锐，以其最大吸收波长为检测波长，会使检测结果受波长误差影响大、标准曲线线性范围过窄；槲皮素和根皮苷的第2个吸收峰虽然不尖锐，但峰形不好、谱线不光滑，难以选择到适宜的检测波长。在可见光谱区，根皮苷和槲皮素均无最大吸收峰；儿茶素和芦丁分别在500nm和510nm有一最大吸收峰，且2者峰形相似、谱线平滑。儿茶素在500nm处的响应值比相同浓度芦丁在510nm处的响应值高0.4倍多，表明儿茶素比芦丁更灵敏，故选择儿茶素为标准品。Fawbush等在测定恩派苹果果实总黄酮含量时即以儿茶素为标准品。2.2 显色剂的选择儿茶素溶液分别用氯化铝、硝酸铝和硫酸铝显色后进行波长扫捕，结果见图2。从图2可见。3条图谱不仅峰形一致，而且几乎完全重叠。新红星苹果的果皮提取液和果肉提取液分别用氯化铝、硝酸铝和硫酸铝显色后进行波长扫描，所得图谱（本文未给出）与儿茶素溶液情况类似。这表明。在测定苹果果实总黄酮含量时，氯化铝、硝酸铝和硫酸铝均可作显色剂，这与前人报道相一致。2.3 检测波长的选择应用分光光度法进行测定时，为使测定结果有较高的灵敏度，通常应选择被测物质溶液的最大吸收波长，不仅吸光度值较大，且受分析波长误差影响较小。儿茶素溶液显色后在紫外光谱区250nm和330mn#有一吸收蜂，在可见光谱区有500nm吸收峰（图3）。苹果果皮提取液和果肉提取液也有3个吸收峰，且位置与儿茶素极为接近，但紫外光谱区的两个峰峰形与儿茶素差异很大，表明果实提取液中类黄酮以外的其他成分对类黄酮吸收紫外光有较强的干扰：可见光谱区的吸收峰峰形与儿茶素几乎完全一致，表明提取液中类黄酮以外的其他成分对类黄酮吸收可见光影响不大，而且该峰较矮、较宽，采用其最大吸收波长为检测波长，标准曲线线性范围大。因此，确定500nm为测定苹果果实总黄酮含量检测波长。2.4 环境温度对显色稳定性的影响儿茶素溶液用氯化铝显色后，其A500随放置时间延长而下降，而且下降速度与环境温度有关，环境温度越高下降越快（图4）o显色定容后将溶液放置在4C环境温度下，A500下降缓慢，平均每小时下降5.3。而将溶液放置在25和40环境温度下，A500急速下降，平均每小时分别下降33.5%和43.5%。苹果果肉和果皮提取液与儿茶素溶液情况类似，但A500下降速度较慢，约为儿茶素溶液的15。有鉴于此，为保证测定结果准确，显色定容后的溶液最好放置在4的低温条件下，并尽快测定其Af用儿茶素溶液绘制标准曲线时尤其如此。2.5 显色反应体系中乙醇浓度的影响无论是苹果果肉还是果皮，显色反应体系中乙醇浓度为8时的测定结果均明显高于乙醇浓度为50时的测定结果（表1），特别是果皮，前者比后者高34.2。试验还发现测定苹果果皮总黄酮含量过程中，当乙醇浓度为50时，溶液显色后有大量絮状沉淀出现。在银杏叶、竹叶和桑黄总黄酮含量测定时也发现了类似问题，这是杂质造成的，杂质在碱性环境下与铝离子形成络合物沉淀，致使测定准确度和重现性变差。将显色反应体系中乙醇浓度降至8，避免了显色后沉淀的出现，而且比采用离心或过滤的方法去除沉淀更加省时、高效，还可降低测定成本。2.6 背景成分对测定的影响采用分光光度法进行样品检测时，参比溶液应包括除待测成分以外的全部背景成分。波长扫描图谱显示，测定苹果果皮和果肉总黄酮含量时，试剂空白和未显色果实提取液对400-600nm可见光均有一定程度的吸收(图5)。应将其扣除，否则会对测定结果产生干扰，使测得的苹果果实总黄酮含量出现虚高现象。以空样品池为参比测定未显色果实提取液的500nm吸光度(A500),再以空白试剂为参比测定果实提取液显色后的500nm吸光度(A500)，2者之差(A500-A500)即为真实吸光度，以此计算果实提取液的总黄酮浓度即可扣除背景成分对测定的影响。2.7 方法的线性范围根据50-300mg?L-1儿茶素系列标准溶液显色后的A500绘制标准曲线，回归方程为C=392.65A500-4.05,相关系数R为0.9998,可见儿茶素溶液浓度与A500之间存在良好的线性关系。应用分光光度法测定样品中某种成分的含量时，一般应控制被测试液的吸光度在0.2-0.7。由此推算。在进行苹果果实总黄酮含量测定时，样品提取液中类黄酮浓度最好控制在75-270mg?L-1，低于75mg?L-1。进行适当浓缩，高于270mg?L-1进行适当稀释。2.8 方法的准确度和精密度用富士、红星、金冠和国光苹果果实进行方法准确度试验和精密度试验。结果显示，果皮中添加38046410mg?kg-1儿茶素，回收率在100.8%104.9%:果肉中添加500mg?kg-1或1000mg?kg-1儿茶素，回收率在101.7%105.0%（表2）。果皮重复样品的总黄酮含量相对标准偏差在0.5%5.0%,果肉重复样品的总黄酮含量相对标准偏差在0.6%1.8%,均不超过5（表3）。这表明，在优化后的条件下。苹果果实总黄酮含量测定结果准确、重复性好。3讨论苹果果实所含类黄酮种类相当多，高效液相色谱法适于类黄酮单体的测定，但因标准品种类的限制，该方法仅能测定其中部分类黄酮，而采用分光光度法则可实现苹果果实总黄酮含量的测定。芦丁溶液显色后其可见光谱区最大吸收波长为510nm,并非报道的500nm采用儿茶素为标准品，灵敏度明显高于芦丁，而且可见光谱区最大吸收波长是500nm（图1）。铝盐是分光光度法测定苹果果实总黄酮含量的显色剂，铝离子与黄酮化合物形成稳定的配合物。显色反应中分别加入氯化铝、硝酸铝和硫酸铝，A500几乎完全一致（图2），因此，选择其中任何一种铝盐作显色剂均可。虽然有人采用A500测定苹果果实总黄酮含量，但本研究表明，可见光谱区的最大吸收峰并不在510nm,而在500nm（图3）,这与王建华等旧的报道相一致。500nm吸收峰较矮、较宽（图3）,以500nm为检测波长，可获得较大的标准曲线线性范围。分光光度法测定总黄酮含量时，显色定容后的环境温度对测定结果有影响，必要时应针对具体样品对其进行优选。本文进行了对比研究，显色定容后的环境温度以4c为宜，溶液A500下降速度明显比环境温度为25和40时慢，反映出显色反应生成的红色配合物在低温条件下更为稳定。采用分光光度法测定总黄酮含量时，显色反应体系中乙醇浓度不同。实验结果差异很大。本研究证明了这一现象，无论是苹果果皮还是果肉，乙醇浓度为8时的测定结果均明显好于乙醇浓度为50时的测定结果，而且高乙醇浓度条件下测定苹果果皮总黄酮含量时还会出现明显的絮状沉淀。分光光度法具有应用范围广、灵敏度高、准确度好、操作简便等优点。本研究结果反映了这些优点，在优化后的条件下，采用分光光度法测定苹果果实总黄酮含量，线性范围宽，精密度和准确度高。本研究结果为苹果果实总黄酮含量分光光度法测定奠定了基础。