多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪

美国怀雅特技术公司多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪联接与应用技术MALLS/GPC(SEC)WYATT TECHNOLOGY CORPORTION(BEIJING OFFICE)地址：北京西直门北大街58号 金晖嘉园7-2302 美国怀雅特技术公司北京代表处邮编：100082电话：8610-82292806传真：8610-82290337多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪的联接与应用WYATT TECHNOLOGY CORPORATION. 一 前言近十几年来，光散射技术（Light scattering）在高分子特征分析领域的应用得到了迅速的发展。将光散射技术和凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC）或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）分离技术相结合，不但可以测得大分子的绝对分子量，分子旋转半径与第二维里系数，还可测得分子量分布，分辨分子量大小不同的族群以及分子的形状，分枝率及聚集态等。目前，该技术已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲已广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。二 光散射简介 早在十九世纪初，人们就开始对光散射原理进行研究。自六十年代激光被发明以来，光散射的原理与技术便得以迅速发展，至今已成为检测微小粒子形状，粒径大小，分子量，界面电位及粒子间效应的重要工具。随着电脑技术的日新月异，许多过去需花费数小时甚至数日才能完成的实验，如今只需数分钟即可完成，而其准确性及重现性也大幅度提高了。 光散射现象，如图1 所示，当一束光通过一间充满烟雾的房间就会产生散射。利用在不同角度，不同时间所测得的光散射强度，再借助各种光学理论及软件，硬件设备，就可以测得微粒的许多特性。入射光散射光图1光散射现象在光散射发展的历程中，以下是一些具有代表性的人物：James Clerk Maxwell (1833-1879)解释了光是一种电磁波，并正确地计算出光的速度。 Lord Rayleigh(1842-1919)研究了远小于波长的微粒散射现象，发现了散射强度与波长的四次方成反比，并解释了蓝天被太阳光穿透大气层所产生的散射现象。 Abert Einstein(1879-1955)研究了液体的光散射现象。Chandrasekhara V.Raman (1888-1970)印度籍物理大师，提出了Raman 效应，其著作多次发表于印度文期刊，直至第二次世界大战结束后才逐渐被人所知。 Peter Debye（1884-1966）延续了Einstein的理论，描述了分子溶解于溶剂中所产生的光散射现象，提出用Debye plot, 求得重量平均分子量Mw。三 光散射理论 激光照射到样品时，会在各个方向产生散射光，于是我们可以在一个角度或多个角度收集散射光的强度。1. 光散射所透露的信息在任何方向的光散射强度与分子量和溶液的浓度成正比；散射光角度的变化与分子的尺寸大小有关。当分子小于10nm时，各个角度的散射强度都相同；当分子介于10至30nm时，散射强度则由低角度向高角度呈直线下降的趋势；而当分子大于30nm 时，散射强度则随角度增大呈曲线下降的趋势。2. 基本理论由Maxwell，Einstein，Debye及 Zimm 等人陆续发展起来，有关溶剂中分子量的光散射现象可由下列公式表达：1K*cR(q)MwP(q)+ 2A2c=（1）式中：常数K*=42(dn/dc)2n02(NA04)n0是溶剂的折光指数。C是溶质分子的浓度（g/mol）。 NA是阿佛加德罗常数。0是入射光的波长。DN/DC是溶液折射率与浓度变化的比值，它说明了随溶质浓度变化的溶液折光指数变化。R(q)是单个角度的散射光（大于溶剂的散射光数量）除以入射光强度所得的分数即不同角度光散射强度。Mw是重均分子量。A2 是第二维里系数P(q) 是光散射强度的函数将P(q)代入式（1）展开得：在上式中，R(q)是测得值，K*c、0、q为输入值，均为已知值；而Mw、A2、rg为未知值。3. Zimm Plot将K* C/ R对sin2(q/2)+kc作图，可得到著名的Zimm曲线，如图2所示，其中K为调整横坐标的设定值。 图2 Zimm PloK*cR(0)1Mw=当 O时，（2）式简化为斜率即是A2+ 2A2c当C 0时，（2）式简化为斜率是rg2当 O， C 0，（2）式简化为K*cR(0)1Mw=在纵座标上交点的倒数即为Mw。实验的方法为配制一组不同浓度的溶液，依次在不同的角度测量其散射光强度，由计算机程序按照上列的公式绘出Zimm Plot，并求得Mw，及A2值，这是极少数能直接测得绝对分子量的方法之一。但由于结果仅为单一平均值，因此较适用于成分单一，分布较窄的分子，对于分布较宽或有不同族群分布的样品，则较难看出全貌。 四 光散射与GPC/SECGPC/SEC可以将溶剂中的分子按重量或尺寸大小依次洗脱出来。利用此项技术将光散射仪器与GPC/SEC联用，除了可以分出不同的族裙，还可测得不同族群的分布，并且不需要另外标准样品做标准曲线。由于光散射信号直接与分子量大小有关，因此可以直接测出重均绝对分子量，并获得其它许多有关的信息。图4 光散射强度与GPC层析图Chromatography with LS Set-up图5 光散射强度与GPC/SEC联用1 Debye plot通常GPC/SEC 的样品注射浓度就很低，再经过色谱柱得到进一步的稀释，图4中光散射信号上的任何一点，其浓度都极低（趋近于零）。根据公式，当2 A2C 0，将K* C/ R对sin2(q/2)+kc作图6，其纵坐标交点即为1/Mw，由直线的斜率可得到，图4光散射信号的每点都可以得到上述结果，由此可以求得分子量及旋转半径的分布，如图7所示：图6 Debye plot图7 分子量对洗脱体积作图图8 积分分子量2 分子形状 不论是分布较宽或是多峰分布的样品，皆可通过测量分子量及分子旋转半径得到分子形状的数据。 球形分子 ri3 Milog ri = k + 1/3 log Mi无规则线团状分子 ri2 Milog ri = k + 1/2 log Mi棒状分子ri1 Milog ri = k + 1/1 log Mi 将log ri， log Mi作图，有直线的斜率可以获知分子的形状，如图9所示：rod (slope = 1)(slope near 0.5-0.6)(slope = 1/3) 棒状（斜率=1） 无规线团（斜率0.5-0.6） logrg 球型(斜率=1/3) logM图9-1 M、rg与分子形状的关系图9-2 构型判断, rg对Mw作图。斜率为0.54 0.01。表明分子是具有无规则线团构象的线性聚合物图9-3 构型判断，rg对Mw作图。斜率大于0.6，表明分子具有伸展结构。斜率为1.0，表明是棒状结构。图9-4 构型判断，rg对Mw作图。其U型曲线表明为典型的高支化度结构。3 需要量多少个角度 在低角度的时候，有杂质所产生的噪音信号干扰会很大，如图10所示，所以只取低角度，加上九十度两个角度，其误差就会相对很大；若只取九十度则只能求得分子量，无法测得旋转半径，所以最起码要加上一组高角度来修正，则误差会较少很多。图10 杂质较多的GPC层析图4 光散射仪器最基本的仪器mini DAWN TREOS如图11所示，在与入射光成45度、90度、135度角配置三组光电二极管检测器，同时检测不同角度的光散射强度，而激光经由样品槽的毛细管通道，样品槽为石英材质。如果要增加测量角度，可以如DAWN HELEOS在样品槽的两侧以不对称得方式增加检测器的数目，如图12所示可高达18个角度之多。图11 三个检测角度五 应用 光散射强度与分子的大小及分子量有直接的关系，而SEC/GPC能分离不同尺寸及分子量的分子，结合此两种特性，可以得到许多有用的信息，并广泛地应用于高分子，生化及动力学等研究领域。图12 十八角度检测器1 高分子聚合物特性利用多角度激光光散射系统（Multi-Angle Laser Light Scattering_ MALLS） 结合SEC/GPC，不必依赖泵的流速，校正曲线及其它任何的假设，即可直接求得重均绝对分子量及分子量分布等数据。IntensityElution VolumeScattering Angle图13 光散射强度，洗脱体积与角度作图MALLS利用色谱柱分离出的样品在各个角度的光散射量（如图13），由RI 检测器得到的洗脱液浓度及dn/dc值，即可计算出各个切片的分子量。MALLS测得绝对分子量所需的各种物性均可由实验直接求得，无需作任何假设。而GPC的色谱柱又有分离杂质的功能，可以避免传统的光散射需极小心准备样品的麻烦。图14显示高分子混合物经SEC分离后MALLS及RI的洗脱体积对照图。由此图看出RI 对大分子量浓度低的物质较不敏感，而对低分子量高浓度者较敏感。图14 这是由ASTRA软件得到的miniDAWN（上）和Optilab示差检测器（下）信号。1 BSA 67,000 64,300700 1% 2 溶解酵素 14,300 14,600300 1%3 缓激肽 1,060 1,09010 2% 4 亮氨酸脑啡肽 556 5926 3%图15分子量对洗脱体积图，有四个明显的峰2 蛋白质及其聚合体在各种工业应用中，决定蛋白质的绝对特性不仅严格而且必要，例如在生化工程应用上，以蛋白质为基质的产品必须很纯而且无任何聚集存在。而测定蛋白质的分子量和是否有聚集态存在，光散射法是最理想的工具之一。以往，在水相中用低角度光散射测量法（LALLS）受到溶剂中不纯的物质干扰相当大。而MALLS的多角度测量大大降低了背景噪音的干扰，并能提供完整的信息和良好的重现性结果。图16显示蛋白质混合物的MALLS 和RI的信号。样品在0.1M NaCl 中含0.05M的磷酸盐缓冲液中进行RI为Wyatt Optilab 903，流速为0.1mL/min ,色谱柱为Shodex KW-803 和KW-804。虽然此样品为标准样品，但MALLS仍很清楚地检测到聚集现象，此现象在RI几乎无法辨认。图16蛋白质洗脱体积及聚集体信号图 3分枝高分子聚合物的分枝程度和分布是影响其物理和化学性质的一个重要因素。采用多角度激光光散射系统（MALLS）与GPC/SEC系统联用是唯一决定分枝系数gM的方法。虽然也有其他确定分枝的方法，但都不能直接且需要众多假设及“虚拟因子”。由传统的RI或Viscometer (粘度检测器) 测定的高枝化分子的分子量与绝对值有很大的差别，若欲做有效的色谱柱校正，则需以一系列与待测物成分相同的标准品作校正。若标准样品与待测物的成分或组分不同，则会产生很大的误差。例如分子量相同的球形高分子的洗脱时间比无规则线团状分子要长。因为MALLS所求得分子量和大小为绝对值，因此计算分枝系数gM不需要任何假设。由MALLS直接所求得的分子大小会直接影响分枝率。对分子量相同的长链状分子而言，其值越小，则分枝程度越大。分枝比的定义为分枝分子的旋转半径与长链分子的旋转半径之比，即gM=b/l由MALLS测得。图17为由MALLS测得的分枝状和长链形的高分子（PS）的旋转半径和分子量对照图。由图中可看出，虽然其分子量相同，但分布明显不同。图18 为rg对 Mw做图。图17 PS线形与枝化分子的对照图图18旋转半径对分子量图（分子构型图），可以看出样品（藻酸钠）在辐射后分子构型的变化。6. 动力学/反应速率MALLS还可以用于如抗原，抗体等反应迅速的溶液系统，粒子和蛋白质聚集现象的检测。因为MALLS 内部同时装有数个固定的检测器，所以不需移动任何仪器硬件来扫描样品，即可及时多方位同时捕捉反应速率的现象。使用MALLS，可研究抗原-抗体反应，反应发生时就可决定聚集粒子的大小。当改变温度，浓度或催化剂时，MALLS可记录下反应发生时，分子的特殊变化。图19 浓度变化对蛋白聚集的影响使用DAWN 检测器研究了浓度对分子量为75KD单分子蛋白质聚集作用的影响。图19描述了这种特殊蛋白质从30ug/ml到1mg/ml范围内得到的浓度相关性。如图所示，该蛋白质在低浓度作为单一分子而在浓度大于700ug/ml时聚集为六聚体。该结果与由gluteraldehyde高度交联技术所得结合完全相符。图20 温度变化对PMMA分子量和大小的影响7. 低分子量的测定DAWN HELEOS或mini DAWN TREOS的固定光电二极管检测器可以捕捉到很微弱的光散射信号，使得分子量的测定成为可能。使用DAWN 系列标准配制的任何一款激光器，都可以轻易地测量分子量低于2000D的聚合物，并具有相当的准确性。 由于DAWN HELEOS 或mini DAWN TREOS具有三个以上的多角度同时捕捉散射信号的能力，即使极微弱的信号，如只比背景值略高的低分子量样品所散射出的信号也可以从不同的角度去捕捉，累计在一起就可以计算出相当准确的结果。这是单角度或者两角度检测器所无法做到的。图21为分子量分别为580、1400及2000D 的聚苯乙烯样品分子量对洗脱体积的对应图。样品量浓度分别为7.1mg/ml，2.9mg/ml及2.2mg/ml。经ASTRA GPC 软件分析得出如表2的平均分子量。图22为分子量分布图。图21 低分子量样品与洗脱体积图图22低分子量样品分子量图表2样品平均分子量Sample Stated MwLow Scattering MwA58051217B1400137129C2000201240一般传统光散射仪给人们的印象是不易测得分子量较低的样品，甚至低于10000D就比较困难了。但是采用最新的多角度激光光散射仪就可以轻易且相当准确的测量分子量低到几百D的样品。 六 结论传统的光散射法只能确定平均分子量，旋转半径及第二维里系数，而GPC/SEC又受泵流速的限制，再加上寻找与待测物结构相似的标准品不易，对低浓度高分子量的部分，如microgel, trimer, dimer等信号不敏感，导致误差增大，色谱柱容易老化。而多角度激光光散射仪(MALLS)与GPC/SEC结合，正可以互相补充，不但可以直接测得绝对分子量，还可以对样品的组成，从低浓度高分子量到高浓度低分子量，都能解析的很清楚，更可以得到许多有用的信息，如分子的形状，分枝状况，聚集态及动力学参数，反应速率等，其功能与应用普及性正与日俱增。16