中药化学011 第二章(一)xin

中药化学Chemistry of Traditional Chinese Medicine第二节第二节 中药有效成分的提取分离方法中药有效成分的提取分离方法有效成分理化性质提取分离技术的原理和特点合适的提取分离方法第二章第二章 中药化学成分的一般研究方中药化学成分的一般研究方法法 提取前先鉴定药材和查阅文献，提取时将药材粉碎成粗粉，常用的提取方法有： 溶剂提取法 水蒸汽蒸馏法 超临界流体萃取法 其他方法： （升华法、组织破碎法、压榨法、超声法、微波提取法等）一、中药有效成分的提取方法第二节 中药有效成分的提取分离方法（一）溶剂提取法原理：溶剂透过药材粉末的细胞膜，溶解溶质，形成细胞内外溶质浓度差，将溶质渗出细胞膜，达到提取目的。1、溶剂的选择（按极性递增的顺序排列）（1）溶剂的分类l 亲脂性溶剂：环己烷，石油醚，四氯化碳，苯，二氯甲烷，氯仿，乙醚，乙酸乙酯l 亲水性溶剂：正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇、乙腈、乙酸l 水 第二节 中药有效成分的提取分离方法极性大极性小水甲醇、乙醇正丁醇乙酸乙酯氯仿乙醚苯丙酮二氯甲烷四氯化碳石油醚第二节 中药有效成分的提取分离方法（2）常用溶剂的特点 氯仿（相对密度1.48 g/cm3 ）比水重，沸点61.7，易挥发。 石油醚，苯，二氯甲烷，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁醇均与水互不相溶（分层）。 丙酮，乙醇，甲醇、乙腈、乙酸与水任意比例混溶。 水：冷水：发生酶解反应，杂质多；热水：效率高，挥发性成分损失，热敏性成分易破坏。第二节 中药有效成分的提取分离方法（3）溶剂的要求 溶解度适当：遵循 “相似相溶”原则，即溶质易溶于与其极性相似的溶剂中；l 萜类和甾体等因极性小，易溶于乙醚等亲脂性溶剂；l 糖苷类等极性大，易溶于水或含水醇等亲水性溶剂；l 酸、碱及两性成分溶解度随pH值改变。 不能发生化学反应； 安全无毒经济易得； 沸点易适中，便于回收，反复使用。第二节 中药有效成分的提取分离方法 被提取成分的极性是选择提取溶剂最重要的依据。 影响化合物极性的因素： (1) 母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。(2) 取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。 基团极性；酸酚醇胺醛酮酯醚烯烷 举例：判断下列各组化合物极性大小。OHOCOCH3OA B C（4）化学成分的极性第二节 中药有效成分的提取分离方法冷提法：浸渍法渗漉法热提法：煎煮法回流提取法连续回流提取法（索氏提取法）（5）提取方法第二节 中药有效成分的提取分离方法（二）CO2超临界流体提取法特点超临界流体密度液体 超临界流体粘度气体 优点1、萃取能力强，大大提高效率2、温度低，热敏性、易氧化分解 的物质不易破坏3、时间短，24小时可完成4、提取物无溶剂残留物5、提取物质量稳定，标准易控制第二节 中药有效成分的提取分离方法（三）水蒸气蒸馏：适用能随水蒸气蒸馏而不被破坏的化合物，且不溶于水。用于挥发油成分。（四）其它方法l 升华法 l 组织破碎提取法l 压榨法 l 超声提取法l 微波提取法第二节 中药有效成分的提取分离方法二、分离精制方法1.溶剂法酸碱溶剂法溶剂分配法 系统溶剂萃取法 逆流分溶法（CCD） 液滴逆流色谱（DCCC）破坏乳化的方法有：（1）加热敷；（2）将乳化层抽滤；（3）长时间放置（24小时以上）。第二节 中药有效成分的提取分离方法1、酸碱溶剂法 对酸性、碱性或两性成分，调节溶液pH值，改变分子存在状态（游离型或离解型），改变溶解度，从而实现分离。 生物碱类成分常用酸水提取后，调至碱性，从水中沉淀析出（酸/碱法）；黄酮、醌类或酚类等酸性成分常用碱水提取后，调至酸性，从水中沉淀析出（碱/酸法）；蛋白质提取后调节PH至等电点使其沉淀析出。第二节 中药有效成分的提取分离方法 pHl对于酸性成分：HA+H2OA-+H3+O pH=pKa+lgA-/HA若使酸性物质完全离解，则pH=pKa+lgA-/HApKa+lg(100/1)pHpKa + 2，酸性物质多呈离解态（90A-）；若使酸性物质完全游离，则pH=pKa+lgA-/HApKa+lg(1/100)pHpKa - 2，酸性物质多呈游离态（90HA）。第二节 中药有效成分的提取分离方法讨论： 已知酚类化合物的pKa 9.210.8；羧酸类化合物的pKa 5，如何调节pH值，改变酚类和羧酸的存在状态？第二节 中药有效成分的提取分离方法 pHl对于碱性成分：B+H2OBH+OH- BH+H2O B+ H3+OpH=pKa+lgB/BH+若使碱性物质完全离解，则pH=pKa+lgB/BH+pKa+lg(1/100)pH pKa - 2，碱性物质呈离解态（ 90BH）；若使碱性物质完全游离，则pH=pKa+lgB/BH+pKa+lg(100/1)pH pKa + 2，碱性物质呈游离态（ 90 B）。第二节 中药有效成分的提取分离方法小结：pH12时，酸性物质多呈离解状态（A-），而碱性物质多呈游离状态（B）。第二节 中药有效成分的提取分离方法分配系数（K值，即分配比） 即在一定温度及压力下，溶质在两相溶剂中的浓度比（K=CU/CL），为一常数。 萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。 极性较大的成分：正丁醇水 极性中等的成分：乙酸乙酯醇水 极性较小的成分：乙醚（或乙酸乙酯）水溶剂分配法第二节 中药有效成分的提取分离方法系统溶剂萃取法按极性递增的溶剂依次萃取： 己烷，石油醚，氯仿（或乙醚），乙酸乙酯，正丁醇，甲醇（或乙醇)第二节 中药有效成分的提取分离方法逆流分溶法（CCD）第二节 中药有效成分的提取分离方法 使流动相垂直上升或下降，通过固定相的液柱，实现物质的逆流色谱分离。液滴逆流色谱 DCCC第二节 中药有效成分的提取分离方法 优点：1）不需振荡两相溶剂，特别适于皂苷类成分的分离；2）不需固体载体，样品无吸附消耗，无污染，无脱尾现象，且可以定量回收。 缺点： 1）必须选用能生成液滴的溶剂系统；2）处理样品量小； 3）要有特定的设备，操作较繁琐。第二节 中药有效成分的提取分离方法 依靠蛇形管的方向性和高速旋转所产生的离心力，使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管内，并使流动相单相、低速通过固定相，实现连续逆流萃取分离物质的目的。高速逆流色谱High Speed Countercurrent Chromatography, HSCCC第二节 中药有效成分的提取分离方法 优点：1）不需固体载体； 2）样品无吸附消耗，无污染，无脱尾现象，且可以定量回收。适用于皂苷、生物碱、酸性成分、蛋白质、糖类的分离精制。 缺点：1）需要特定的设备； 2）处理样品量小。第二节 中药有效成分的提取分离方法（二）沉淀法1专属试剂沉淀法 生物碱类 雷氏铵盐甾体皂苷、 三萜皂苷胆甾醇甾体皂苷2. 分级沉淀法水/醇法（除去糖、蛋白质等水溶性杂质）醇/水法（除去树脂、叶绿素水不溶性杂质）醇/醚法（沉淀皂苷成分与脂溶性杂质分离）3盐析法 第二节 中药有效成分的提取分离方法（三）分馏法（沸点）（四）膜分离法（外加压力或化学位差分子大小）（五）升华法第二节 中药有效成分的提取分离方法膜分离技术膜分离技术原理：是以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位差等）时，原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯的目的。特点： 常温操作，特别适用于热敏性物质的分离、浓缩； 简化工艺，缩短生产周期，分离效率高，降低有效成分的损失，同时去除杂质； 分离选择性高，可分级分离；除菌除热源效果好； 分离不耗用有机溶媒（如乙醇），有利于减少环境污染； 选择范围广，适用性强；且易于连续化和自动化操作。 第二节 中药有效成分的提取分离方法类型：类型：按分离功能分类微滤（0.110 m）：用于截留颗粒物，液体的澄清及大部分细菌的去除。超滤（10100 nm）：近似于机械筛，主要用于几千至数十万的物质的分级分离、提纯和浓缩。纳滤（110 nm）：用于3001000的小分子物质，集浓缩与透析为一体。可分步滤除粉针剂中无机盐和多糖成分。反渗透（1 nm）：用于制备高品质水。使用有机膜，从水溶液中除去无机盐和小分子物质，主要用于脱盐纯化，可代替离子交换树脂。第二节 中药有效成分的提取分离方法应用：应用：1）用于提取中药有效成分：如采用超滤法对黄芩苷进行提取，其收率、纯度及颜色方面较常规水醇法优。2）用于制备中药注射剂：采用超滤法可去除中药煎液中大量的蛋白、淀粉、树脂、鞣质等大分子物质及絮状物等。3）用于制备中药口服液：采用超滤法较醇沉法能更多地去除料液中的杂质，从而节省试剂、简化工序、缩短生产周期。4）用于制备药酒等其他中药制剂用于药酒生产可提高药酒的内在质量、稳定性和澄明度。第二节 中药有效成分的提取分离方法影响结晶的因素：结晶用溶剂的选择（1）要对被结晶成分热时溶解度大、冷时溶解度小； 对杂质或冷热时都溶解，或冷热时都不溶解。（2）与被结晶成分不发生化学反应。（3）沸点不宜太高。（六）结晶法 提取或分离物 溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤 溶液 放置（冷藏）析晶，过滤 粗结晶 重复上述操作（重结晶） 结晶第二节 中药有效成分的提取分离方法吸附色谱凝胶过滤色谱大孔树脂色谱离子交换色谱分配色谱（七）色谱分离法第二节 中药有效成分的提取分离方法1、吸附色谱l 硅胶 氧化铝：极性吸附l 活性炭：非极性吸附l 聚酰胺：氢键吸附(酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基)第二节 中药有效成分的提取分离方法物理吸附 也叫表面吸附，由分子间作用力引起，遵循“相似者易于吸附” 原理。（1）基本特点：无选择性、可逆、快速吸附（2）基本要素：溶剂、溶质、吸附剂溶剂溶质吸附剂第二节 中药有效成分的提取分离方法常见的吸附剂 l 硅胶：显微酸性，适于分离酸性和中性化合物，若分离生物碱时需在流动相中加入适量的有机碱；l 氧化铝：呈碱性，适于分离生物碱等碱性成分，不宜用于分离有机酸、酚性等酸性成分。第二节 中药有效成分的提取分离方法l 活性炭 非极性吸附剂，对非极性溶质具有较强的亲和力，在水中对溶质吸附能力强；溶剂的极性越小，洗脱能力越强。反之，越弱。第二节 中药有效成分的提取分离方法l聚酰胺原理：聚酰胺通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。特点：聚酰胺不溶于水及有机溶剂，对碱稳定，但可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。第二节 中药有效成分的提取分离方法 极性与非极性的成分均可适用；l 特别适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物；l 聚酰胺对鞣质吸附特强，近乎不可逆，可用于粗提物的脱鞣处理。应用第二节 中药有效成分的提取分离方法（凝胶渗透色谱、分子筛滤过、排阻色谱） 原理：分子筛作用 葡聚糖凝胶（sephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)第二节 中药有效成分的提取分离方法 2、凝胶过滤色谱洗脱规律或出柱顺序： Ve = K1-K2lg M 分子量M越大，洗脱体积Ve 越小，越先出柱。故被分离的物质按分子由大到小的顺序先后流出并得到分离。第二节 中药有效成分的提取分离方法常见的凝胶种类凝胶系列数字吸水量10，如葡聚糖凝胶G-25的吸水量为2.5 ml/g。不同分子量的物质的分离需要不同规格凝胶；葡聚糖凝胶Sephadex G系列只适于在水中应用。 1）葡聚糖凝胶Sephadex G系列第二节 中药有效成分的提取分离方法2）羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20系列 为Sephadex G-25经羟丙基化后的产物，应用较广。具有分子筛特性，可按分子量大小分离物质；在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的作用，适合于不同类型有机物的分离。Sephadex LH-20即能在水中，也能在有机溶剂中或者含水的混合溶剂中应用。第二节 中药有效成分的提取分离方法（4）应用 广泛应用于黄酮类、苷类、生物碱、蛋白、多糖等成分的纯化。 例如葡聚糖凝胶G和 LH-20分离黄酮苷元时，主要靠吸附作用，苷元酚羟基越多，越难洗脱；分离黄酮苷时，主要靠分子筛作用。第二节 中药有效成分的提取分离方法3、大孔吸附树脂原理：吸附性和分子筛性原理相结合吸附性：范德华引力或氢键的分子筛：多孔性应用：比较广泛，可用于糖与苷的分离、生物碱的精制多糖、黄酮、三萜类化合物等的分离与精制。第二节 中药有效成分的提取分离方法4、分配色谱原理：被分离成分在固定相和流动相之间的 分配系数不同正相分配色谱：流动相极性固定相极性HPLC、MPLC、LPLC第二节 中药有效成分的提取分离方法 正相分配色谱l特点：固定相极性流动相极性l支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素粉等l固定相：水、缓冲溶液等l流动相：固定相饱和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等有机溶剂l洗脱顺序：化合物极性越小，越先出柱；化合物极性越大越后出柱。l应用：可用于分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。（2）液-液分配柱色谱固定相流动相第二节 中药有效成分的提取分离方法 反相分配柱色谱l特点：固定相极性流动相极性l支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素粉等l固定相：石蜡油等弱极性溶剂l流动相：固定相饱和的水或甲醇等强极性溶剂l洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；化合物极性越小，越后出柱。l应用：适合于分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。第二节 中药有效成分的提取分离方法 液液分配薄层色谱法特点：可在薄层上进行，快速、灵敏。应用：液液分配薄层色谱结果（正相柱用正相薄层色谱，反相柱用反相薄层色谱）可用于选定相应的液液分配柱色谱最佳分离条件。第二节 中药有效成分的提取分离方法 加压液相色谱法载体：比经典液相色谱柱颗粒直径（100-150 m）小，只有5, 10, 40-60 m，比表面积较大的多孔型硅球，并键合不同极性的化合物，提高柱效。流速：加压，快速收集：自动化，省时第二节 中药有效成分的提取分离方法 类型：依据压力大小，加压液相色谱法又分为： 快速柱色谱（约2.02105 Pa） 低压柱色谱（20.2105 Pa）第二节 中药有效成分的提取分离方法 固定相：常用键合固定相。 键合固定相是普通硅胶（Si-OH）上键合长度不同的烃基（R），形成亲油表面而成。 键合固定相以硅烷化键合型最为常用，根据键合烃基（R）的长度（-C2H5、-C8H17、-C18H37、）分别命名为：RP-2、RP-8、RP-18。三者亲脂性强弱顺序：RP-18 RP-8 RP-2。 键合固定相的作用同时具有分配和吸附作用。第二节 中药有效成分的提取分离方法 流动相：水-甲醇或水-乙腈 洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。 应用：常用于分离水溶性或极性较大的成分，如苷类。 第二节 中药有效成分的提取分离方法（1）原理 天然有机化合物中，具有酸性、碱性及两性基团分子在水中多呈离解状态，与离子交换树脂上的交换基团发生不同程度的交换而被吸附，随后用适当的溶剂进行洗脱，从而实现分离。第二节 中药有效成分的提取分离方法5、离子交换色谱（2）离子交换树脂结构与性质 母核部分+离子交换基团 母核部分结构： 以强酸性阳离子交换树脂为例（如图）母核部分交联度越大，网孔越小；交联度越小，网孔越大。第二节 中药有效成分的提取分离方法 树脂类型： 阳离子交换树脂强酸性（-SO3-H+）弱酸性（ -COO-H+ ） 阴离子交换树脂强碱性（-N+(CH3)3Cl-）弱碱性（ -NH2，NH， -N），仍可用离子交换树脂分离。例如将三者混合物的水溶液通过NH4+型弱酸性树脂，先用水洗下（），再用 NH4Cl洗下（），最后用Na2CO3洗下（）。第二节 中药有效成分的提取分离方法 用于电荷相同且离解程度非常近似的混合物 采用离子交换色谱法。关键在于选好固定相（树脂，干燥、粉碎，200400目）及流动相（缓冲液）。第二节 中药有效成分的提取分离方法(一) 光照的影响 光不稳定物质分离时要避光。(二) 酸碱的影响 酸、碱条件下不稳定的物质要在中性条件下分离。(三) 温度的影响 热不稳定物质分离时要低温进行。(四) 溶剂的影响（采用分析纯试剂）(五) 吸附剂的影响（采用纯度高，杂质少的填料）(六) 溶质的影响提取与分离注意事项第二节 中药有效成分的提取分离方法思考题（1）1、简述溶剂法提取有效成分的基本原理。怎样选择适宜的溶剂？2、将下列有机溶剂按亲水性强弱顺序排列：乙醇、环己烷、正丁醇、丙酮、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、苯。3、中草药有效成分的提取方法有哪些？4、“水提醇沉法”和“醇提水沉淀法”各沉淀哪些成分? 酸/碱法和碱/酸法分别适合哪类成分的提取？5、叙述液液萃取法中分离因子的含义。6、如何调节pH值使酸性物质基本游离？7、如何调节pH值使碱性物质基本离解？8、根据物质在两相溶剂中分配比差异进行分离的色谱方法有哪些？9、何谓液液分配柱色谱（CC）？何谓正相、反相分配色谱？各有何特点？10、何谓键合固定相？说明常用反相键合固定相的种类和特点。1. 简述常见官能团的极性顺序，化学成分的极性取决于哪些因素？2.硅胶在吸附色谱中与在分配色谱中作用有什么不同？3. 简述吸附色谱的三要素。4. 极性吸附有何特点？如何选择洗脱剂？洗脱顺序如何？5. 聚酰胺吸附有何特点？用水醇作洗脱剂时，如何改变溶剂的比例？洗脱顺序如何？6. D101大孔树脂吸附有何特点？用水醇作洗脱剂时，如何改变溶剂的比例？洗脱顺序如何？7. 葡聚糖凝胶SephadexLH-20有何特点？分离苷类成分时，洗脱顺序如何？8. 简述离子交换树脂分离的基本原理、分类依据，酸性物质用何种离子交换树脂？洗脱顺序如何？9. 如何确定化合物纯度？思考题（2）1中药化学成分大多属于（ ），按成分的生物合成途径可分为（ ）和（ ）。2中药二次代谢产物的主要生物合成途径为（）、（ ）、（）、（ ）和复合途径3通过乙酸-丙二酸途径能生成（ ）、（）、（）等化合物。4通过甲戊二羟酸途径能生成（ ）、（ ）化合物。5通过莽草酸途径衍化生成（）、（）、（）等化合物。6中药有效成分的提取分离方法应根据被提取成分的（）和考虑各种提取分离技术的（）和（ ）进行选定，使所需要的成分能充分地得到提取和分离。7采用溶剂法提取中药有效成分时主要是选择（），溶剂按（）可分为三类，即（），（）和（ ）。8超临界萃取法是一种集（）和（ ）于一体，又基本上不用（ ）的新技术。9中药化学成分中常见基团极性最大的是（ ），极性最小的是（ ）。10利用中药成分混合物中各组成分在两相溶剂中（），可采用（）达到分离。11加入（ ）后可降低某些中药化学成分在溶液中的（），而自溶液中析出的特点，可采用（ ）进行分离。12凝胶过滤色谱又称排阻色谱、（），其原理主要是（），根据凝胶的（）和被分离化合物分子的（）而达到分离目的。13离子交换色谱主要基于混合物中各成分（）差异进行分离。离子交换剂有（）、（）和（）三种。14大孔树脂是一类没有（ ），具有（ ），（ ）的固体高分子物质，它可以通过（ ）有选择地吸附有机物质而达到分离的目的。