第10章核酸分子杂交技术

1第10章 核酸分子杂交技术 遗传与分子生物学系遗传与分子生物学系 于杰于杰 2 核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。件下按碱基配对原则形成双链的过程。 不同来源的不同来源的DNA或或RNA单链在一定条件下单链在一定条件下重新组成的新的双链分子重新组成的新的双链分子杂交分子。杂交分子。 3第一节第一节 核酸杂交的基本理论核酸杂交的基本理论一、变性与复性一、变性与复性 4 DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。56解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)：使50%的DNA发生变性时的环境温度。DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。78增增色效应：色效应： DNA变性后对变性后对260nm紫外光收紫外光收增加增加的现象。的现象。9DNA的复性（的复性（renaturation)： 在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNA的两条的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。构的过程。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复经缓慢冷却后即可复性，此过程称为性，此过程称为退火退火(annealing)。1011减色效应减色效应：变性变性DNA复性后复性后对对260nm紫外光紫外光吸收减少的现象吸收减少的现象。121. 常用的变性方法：常用的变性方法： 热变性热变性 酸碱变性酸碱变性 化学试剂变性化学试剂变性 132. 影响复性的因素影响复性的因素 序列简单的分子复性快，如序列简单的分子复性快，如poly(dT)和和poly(dA)识别快识别快 DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 离子强度离子强度有利于复性有利于复性 DNA浓度浓度复性复性 Tm值的估算值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺（甲酰胺%） 14核酸杂交：核酸杂交：不同来源不同来源的两条核酸单链由的两条核酸单链由于于具有互补序列具有互补序列，在一起复性时，互补，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。序列配对，形成杂化分子。+151617二、影响杂交的因素二、影响杂交的因素 1. 核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度 2. 温度：比温度：比Tm低低2530较适宜较适宜3. 离子强度：离子强度离子强度：离子强度杂交反应率杂交反应率 18 4. 杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺 甲酰胺能降低核酸杂交的甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，含含30%50%甲酰胺的杂交溶液温度能甲酰胺的杂交溶液温度能降低到降低到3042。 使用甲酰胺的优点：使用甲酰胺的优点： 低温下探针更稳定；低温下探针更稳定； 能更好地保留非共价结合的核酸。能更好地保留非共价结合的核酸。19注意：注意：待测核酸顺序与探针顺序同源性高待测核酸顺序与探针顺序同源性高的杂交，用水溶液时取的杂交，用水溶液时取68，用，用50%甲酰胺溶液时甲酰胺溶液时取取40。 待测核酸顺序与探针同源性不高时，待测核酸顺序与探针同源性不高时，以以50% 甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3540杂交。杂交。205. 核酸分子的复杂性直接影响复性几率。核酸分子的复杂性直接影响复性几率。6. 非特异性杂交反应：在杂交前将非特异非特异性杂交反应：在杂交前将非特异性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。性吸附作用。常用封闭物：常用封闭物：变性非特异变性非特异DNA：鲑鱼精子：鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺小牛胸腺DNA 高分子化合物：高分子化合物：Denhardt溶液溶液 脱脂奶粉脱脂奶粉 21第二节第二节 核酸探针核酸探针 一、探针的选择原则一、探针的选择原则 1. 高度的特异性高度的特异性 2. 制备探针的难易性和检测手段的灵敏法制备探针的难易性和检测手段的灵敏法 二、探针的种类二、探针的种类 221. 基因组基因组DNA探针探针从基因组从基因组DNA文库中选取某一基因片段文库中选取某一基因片段 与载体连接（质粒、噬菌体）与载体连接（质粒、噬菌体） 克隆克隆(PCR扩增扩增)酶切酶切优点：优点：无性繁殖、制备方法简单；无性繁殖、制备方法简单；不易降解不易降解（与（与RNA比较）；比较）；标记方法成熟。标记方法成熟。 232. cDNA探针（探针（complementary DNA） S1核酸酶切平两端核酸酶切平两端优点：优点：不含内含子及高度不含内含子及高度重复序列但不易获得重复序列但不易获得 载体连接载体连接克隆克隆通过逆转录通过逆转录双链双链cDNA加接头加接头限制酶限制酶 粘性末端粘性末端243. RNA探针：检测探针：检测DNA和和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少杂交较少,未杂交探针可用未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。降解，减少本底的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂缺点：易降解，标记方法复杂 254. 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 优点：优点：可根据需要合成相应序列；可根据需要合成相应序列； 探针短探针短,序列复杂性低序列复杂性低,分子量小，分子量小，因此杂交时间短因此杂交时间短;长长 度只有度只有1050bp，该识别序，该识别序列内列内1个碱基的变化可明显降低杂个碱基的变化可明显降低杂交交Tm值。值。 可大量合成，价格低，能够用酶可大量合成，价格低，能够用酶学或学或 化学方法进行非放射性标记。化学方法进行非放射性标记。 26三、探针设计原则：三、探针设计原则： 长度：长度：1050bp 碱基成分碱基成分:G+C含量为含量为40%60% 探针分子内无互补序列。探针分子内无互补序列。 避免同一碱基重复出现。避免同一碱基重复出现。 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过超过70%或有连续或有连续8个或更多的碱基同源。个或更多的碱基同源。27四、探针标记物的选择四、探针标记物的选择 理想的标记物：理想的标记物： 具有高度的灵敏性具有高度的灵敏性与探针结合后，不影响杂交及探针的主与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性要理化特性检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉；低，环境污染少，价格低廉；若用酶促方法标记，应对若用酶促方法标记，应对Km影响不大影响不大28（一）常用的放射性标记物（一）常用的放射性标记物 1.常用探记探针的同位素：常用探记探针的同位素：32P、3H、35S、14C、125I、131I292. 特性：特性： 检测特异性强；检测特异性强；灵敏度高；灵敏度高；对酶促反应无任何影响，也不影响碱对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；基配对的特异性和稳定性；易造成放射性污染；易造成放射性污染；半衰期短的同位素应用受到限制，随用半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。随标记，立即使用，不能长时间存放。303. 探针标记的方法探针标记的方法 缺口平移法（缺口平移法（nick translation）实质：用实质：用-32PdNTP取代原来取代原来DNA链链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记。条链均被同位素标记。3132随机引物法（随机引物法（random priming）人工合成的人工合成的68个核苷酸长的各种不同排列个核苷酸长的各种不同排列顺序的混合物，它们可以随机地互补到顺序的混合物，它们可以随机地互补到DNA探针的某一处，作为引物，在探针的某一处，作为引物，在Klenow片段作用下，合成与探针片段作用下，合成与探针DNA互补的互补的DNA链，当在反应液中加入链，当在反应液中加入-32PdATP时，即时，即可形成放射性同位素标记的可形成放射性同位素标记的DNA探针，但探针，但探针探针DNA序列是长短不等的。序列是长短不等的。优点：比活度高，结果稳定优点：比活度高，结果稳定3334用用T4多核苷酸激酶标记多核苷酸激酶标记DNA5末端末端 5-pCpGpApCpG-3 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AKP） 5-HOCpGpApCpG-3 -32PATPT4噬菌体多核苷酸激酶（噬菌体多核苷酸激酶（PNK） 5-32PCpGpApCpG-3 35Klenow片段快速标记DNA探针末端 用枯草杆菌蛋白酶切割可得两条多肽链 N C53外切酶 35外切酶 53聚合酶 小片段(36000) Klenow片段（67000） 3CTTAAG55GAATTC3EcoR 5G AATTC3 3CTTAA G5 Klenow, dNTP,-32PdATP 5GAATT AATTC3 3CTTAA TTAAG5 36（二）常用的非放射性标记（二）常用的非放射性标记 优点：无环境污染，可较长时间贮存优点：无环境污染，可较长时间贮存方法：方法：1.酶标记法酶标记法 2.化学标记法化学标记法要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。三维空间构象的形成。常用的标记物：生物素（常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（）、光生物素（photobiotin）、）、补骨脂素、补骨脂素、2-乙酰氨基芴（乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）371. 生物素标记核酸探针生物素标记核酸探针Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。等。2. 地高辛（地高辛（Dig）标记核酸探针）标记核酸探针383940414243第三节第三节 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 一、类型：根据反应环境分为一、类型：根据反应环境分为1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定 在固体支持物上，另一条核酸在固体支持物上，另一条核酸 链游离在液体中。链游离在液体中。2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游液相杂交：参与反应的两条核酸链都游 离在液体中。离在液体中。44二、固体支持物种类二、固体支持物种类硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板等。微孔板等。选择原则：选择原则： 具有较强的结合核酸的能力；具有较强的结合核酸的能力； 与核酸的结合比较稳定与核酸的结合比较稳定 尽量少的非特异性吸附尽量少的非特异性吸附45三、常用固相杂交类型三、常用固相杂交类型Southern印迹杂交、印迹杂交、Northern印迹杂、印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。组织原位杂交、夹心杂交等。461. Southern 印迹杂交印迹杂交主要步骤：主要步骤：47纯化的待测纯化的待测DNA样品样品 琼脂糖凝胶电泳分离酶切琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段片段 凝胶上凝胶上DNA变性变性 中和中和 DNA转印至转印至NC膜膜 预杂交预杂交 限制性内切酶酶切后（限制性内切酶酶切后（EDTA，65灭灭活限制酶）活限制酶） 变性液（碱变性）变性液（碱变性） Tris缓冲液缓冲液 高盐下高盐下 烘干、固定烘干、固定 杂交杂交 放射自显影放射自显影 结果分析结果分析 4849southern印迹印迹载体载体凝胶凝胶吸水纸吸水纸缓冲液缓冲液滤纸滤纸固定到载体固定到载体502. Northern印迹杂交 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到NC膜上的方法。与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blotting。3. 斑点杂交（dot blot ）(线状圆形)514.原位杂交原位杂交（in situ hybridization） 直接用探针与细胞或组织切片中的直接用探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。核酸杂交。应用：应用：1）观察基因在组织中的表达）观察基因在组织中的表达 2）确定基因在染色体中的定位）确定基因在染色体中的定位525. 菌落原位杂交（colony situ hybridization）将细菌从平板转移到NC膜上 裂解细菌释出DNA 烘干 杂交 53四、核酸杂交的应用四、核酸杂交的应用 在医学研究与实践中，核酸杂交主要用在医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因诊断。于基因诊断。 1、遗传病的诊断：例：、遗传病的诊断：例：-地中海性贫血地中海性贫血 的检验的检验 2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速鉴定鉴定3、癌基因点突变分析、癌基因点突变分析4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子鉴定及亲子鉴定54一、蛋白质的免疫印迹（一、蛋白质的免疫印迹（western)场所：硝酸纤维素膜场所：硝酸纤维素膜待检分子：蛋白待检分子：蛋白探针：抗体探针：抗体杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与蛋白杂交，检测特定的蛋白。蛋白杂交，检测特定的蛋白。55二、所用抗体二、所用抗体1、一抗：针对待测分子的抗体、一抗：针对待测分子的抗体2、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素同位素或生物素56三、操作过程三、操作过程蛋白的制备蛋白的制备SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不凝胶电泳分离不同的蛋白质同的蛋白质57蛋白印迹蛋白印迹封闭封闭+阳极阳极-阴极阴极多孔垫片多孔垫片滤纸滤纸凝胶凝胶载体载体58杂交（一抗与特定蛋杂交（一抗与特定蛋白结合）白结合）漂洗去除多余的漂洗去除多余的一抗一抗二抗与一抗结二抗与一抗结合合漂洗去多余的二漂洗去多余的二抗抗结果检测结果检测