14第十四章基因工程

目目 录录第第 十十 四四 章章 Genetic Recombination and Genetic Engineering目目 录录 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 目目 录录重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 在美国南旧金山建立世界上在美国南旧金山建立世界上第一家第一家遗传工程公司，专门遗传工程公司，专门应用重组应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1996年年 英国罗林研究所成功的克隆了多利英国罗林研究所成功的克隆了多利目目 录录1996年年7月月5日日 英国英国 爱丁堡爱丁堡罗斯林研究所罗斯林研究所“克隆绵羊克隆绵羊”成成功，引起轰动。功，引起轰动。目目 录录多利档案多利档案 姓名：姓名：Dolly 性别：雌性别：雌 种族：哺乳纲，牛科，绵羊种族：哺乳纲，牛科，绵羊 出生：出生：1996年年7月月5日：出生地：苏格兰日：出生地：苏格兰 基因父亲：无基因父亲：无 基因母亲：一只基因母亲：一只Finn Dorset种白绵羊种白绵羊 线粒体母亲：一只苏格兰黑脸羊线粒体母亲：一只苏格兰黑脸羊 生育母亲：另一只苏格兰黑脸羊生育母亲：另一只苏格兰黑脸羊 进入社交圈时间：进入社交圈时间：1997年年2月月23日日 子女：生育子女：生育6名，存活名，存活5名名 死亡：死亡：2003年年2月月14日日 目目 录录多利档案 在微电流刺激下，白绵羊的细胞核与黑脸羊的无在微电流刺激下，白绵羊的细胞核与黑脸羊的无核卵子融合到一起，开始分裂、发育，成为胚胎，植核卵子融合到一起，开始分裂、发育，成为胚胎，植入另一只母羊的子宫里继续发育。在入另一只母羊的子宫里继续发育。在277个成功与细胞个成功与细胞核融合的卵子只有核融合的卵子只有29个存活下来，被移植到个存活下来，被移植到13头母羊头母羊体内。移植手术后体内。移植手术后148天，天，1996年年7月羊羔诞生了月羊羔诞生了1277，其它的都失败了。，其它的都失败了。目目 录录克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。技术水平技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) 即即DNA 克隆，基因克隆克隆，基因克隆细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）原意是指复制原意是指复制目目 录录应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我复制能接合成一具有自我复制能力的力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通过转化，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也分子，也称称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 目目 录录生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。目目 录录（二）工具酶（二）工具酶v 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶v DNA聚合酶聚合酶v 逆转录酶逆转录酶v T4DNA连接酶连接酶v 碱性磷酸酶碱性磷酸酶v 末端转移酶末端转移酶v Taq DNA聚合酶聚合酶目目 录录重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段反转录酶反转录酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶末端转移酶末端转移酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶功功 能能识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNA催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二酯键，使羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双第二链合成，双链链DNA 3 末端标记等末端标记等合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基切除末端磷酸基目目 录录定义定义限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其周并在识别位点或其周围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H目目 录录作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）目目 录录特性特性I型型II型型III型型限制和修饰活性限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶 具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质核酸内切限制酶的蛋白质结构结构3种不同的亚基单一的成份 2种不同的亚基 切割位点切割位点在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近 距寄主特异性位点3端2426bp处甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序列进行识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割核酸内切酶切割 能能能序列特异的切割序列特异的切割不是是是DNA克隆中的用处克隆中的用处无用十分有用用处不大目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口目目 录录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口553333目目 录录来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功异源酶：同功异源酶：目目 录录有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶目目 录录（三）目的基因（三）目的基因v cDNA (complementary DNA)v基因组基因组DNA (genomic DNA)目目 录录（四）基因载体（四）基因载体定义定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA目目 录录克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。设计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。多肽链而特意设计的载体称为表达载体。目目 录录v能自主复制；能自主复制；v具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；和鉴定；v有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；一酶切位点，称为多克隆位点；v分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。v在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代。在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代。目目 录录*: *质粒（质粒（plasmid） 噬菌体（噬菌体（phage） 病毒（病毒（virus） 克隆载体（克隆载体（cloning vector） 表达载体（表达载体（expression vector）常用的载体按来源分为常用的载体按来源分为载体按得到的产物分类可分为载体按得到的产物分类可分为目目 录录1. 1. 质粒质粒 (plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息些遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 概念概念目目 录录目目 录录氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因四环素抗四环素抗性基因性基因多克隆位点多克隆位点目目 录录 2.噬菌体噬菌体（感（感 染大肠杆菌病毒）染大肠杆菌病毒） 噬菌体（噬菌体（lambda bacteriophage）DNA，为线性双链，为线性双链DNA，它的两端各有，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称个碱基的互补粘性末端，称COS位点。位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。子。DNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。目目 录录噬 菌 体头部头部尾部尾部尾丝尾丝目目 录录裂解生长裂解生长噬菌体感染细菌示意图 裂解生长裂解生长：环状：环状DNA在细菌在细菌中多次复制，并合成大量噬菌中多次复制，并合成大量噬菌体基因产物，然后装配成噬菌体基因产物，然后装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌。体颗粒，裂解宿主菌。溶源生长溶源生长：噬菌体噬菌体DNA整整合到细胞染色体基因组合到细胞染色体基因组DNA中，中，与染色体与染色体DNA一起复制，并遗一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。裂解。目目 录录 噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，而对裂解生长并非绝对需要，因此可以被外源性而对裂解生长并非绝对需要，因此可以被外源性DNA取代。取代。 外源性外源性DNA目目 录录限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库目目 录录目目 录录M13噬菌体载体噬菌体载体 M13噬菌体基因组是噬菌体基因组是单链环状单链环状DNA，当它侵犯，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链环状宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链环状DNA转变成复制型双链环状转变成复制型双链环状DNA，可提取出来作，可提取出来作为基因载体。为基因载体。 目目 录录质粒质粒pUC19互补互补：单独存在的：单独存在的及及 片段都没有半乳糖苷酶的片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有时，宿主细胞内才有 半半乳糖苷酶活性，使特异性乳糖苷酶活性，使特异性作用物（作用物（X-gal）变为）变为蓝蓝色化合物色化合物。突变型突变型lac- E.coli表达表达-半乳糖苷半乳糖苷酶的酶的 片段片段。如果插入的外源基因是在如果插入的外源基因是在lacZ基因内，就会影基因内，就会影响响lacZ的表达，利用的表达，利用lac- E.coli为转染或感染细为转染或感染细胞，在含胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现的培养基上生长时会出现白色菌白色菌落落；若无外源基因插入，则出现；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落蓝色菌落。多克隆位点多克隆位点编码编码-半乳半乳糖苷酶的糖苷酶的片段片段目目 录录3. 粘粒粘粒(柯斯质粒载体柯斯质粒载体cosmid vector )目目 录录酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他目目 录录二、重组二、重组DNA技术技术基本原理基本原理目目 录录 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录目目 录录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 化学合成法化学合成法2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第（见第21章）章） 目目 录录* 1. 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列目目 录录组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因目目 录录基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合目目 录录2. 基因组基因组DNA文库（文库（ genomic DNA） 存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组基因组DNA片段的集合称为基因组片段的集合称为基因组DNA文库。文库。基因组基因组DNA基因片段基因片段重组重组DNA分子分子 重组子重组子目目 录录mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 3. 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录目目 录录3. cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 cDNA 文库，文库，cDNA library逆转录逆转录mRNAcDNA目目 录录 cDNA文库的特点文库的特点代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。达的基因。mRNA分子中不包括内含子及调控序列，所以分子中不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。文库的复杂性要比基因组文库低的多。 目目 录录基因克隆的基本步骤基因克隆的基本步骤目目 录录粘性末端粘性末端质粒质粒目的基因目的基因粘性末端粘性末端匹配的粘性末端匹配的粘性末端目目 录录酶切后的目的基因片段酶切后的目的基因片段接接(连接连接)连接后的重组连接后的重组质粒质粒DNA分子分子目目 录录重组质粒重组质粒目的基因目的基因大肠杆菌大肠杆菌转转(转化转化)染色体染色体真好玩!目目 录录筛筛(筛选筛选)分解抗生分解抗生素的酶素的酶含抗生素的培养基含抗生素的培养基还活着还活着!玩完啦玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌目目 录录大量生长大量生长提取大量提取大量质粒质粒酶酶切切鉴定鉴定目目 录录基因克隆的基因克隆的*主要步骤主要步骤v分分:分离目的基因和载体分离目的基因和载体DNA。v切切:用合适的酶切割上述两者，产用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端。生匹配的末端。v接接:连接酶连接目的基因和载体，连接酶连接目的基因和载体，形成重组形成重组DNA分子。分子。v转转:重组重组DNA分子转入受体菌。分子转入受体菌。v筛筛:筛选具有抗药性的阳性克隆。筛选具有抗药性的阳性克隆。目目 录录483页页目目 录录Kary B. MullisUSA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method (1985年年) 1985年，美国年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研公司的人类遗传研究室究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。段的愿望成为现实。 目目 录录 PCR PCR 的基本原理的基本原理v根据活体细胞根据活体细胞DNA复制的机理及双链复制的机理及双链DNA在体外在体外可随温度变化发生变性和复性的特点设计的。可随温度变化发生变性和复性的特点设计的。v体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增目的基因或地扩增目的基因或DNA片片段的技术段的技术.目目 录录PCR反应体系与反应条件反应体系与反应条件 成分成分 加量（加量（ul）灭菌双蒸水灭菌双蒸水 X10PCR 缓冲液缓冲液 5.0MgCl 2 2-8.0dNTPs 1- 2.0引物引物A 1-2.0引物引物B 1-2.0Taq酶酶 0.25模板模板目目 录录PCR反应条件反应条件变性变性 95 5min变性变性 95 1min退火退火 55 1min延伸延伸 72 1min延伸延伸72 5min35 cycles目目 录录v与体内与体内DNA解链过程不同，解链过程不同，PCR中作为模板中作为模板的的双链双链DNA是通过是通过95左右的左右的高温高温使其发生使其发生变性，形成变性，形成单链单链DNA 目目 录录 v PCR通常需要通常需要两条寡核苷酸两条寡核苷酸链作为链作为DNA合成时的合成时的引物引物（primer）,通过控制通过控制退火退火条件，引物就能准确地与扩增区条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。域的两端配对。primers33引物引物目目 录录v在在PCR反应体系中的反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（离的单核苷酸（dNTPs）由引物）由引物53方向，按碱基配对方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。互补的复制链。Taq 酶酶dNTPSl 新合成的链又可作为下轮循环反应的模板新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。 目目 录录 热变性热变性-复性复性-延伸延伸的过程就是一个的过程就是一个PCR循环，循环， 每一循环每一循环后的模板均比前一循环增加后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，经倍。理论上讲，经n次循环后，次循环后，扩增的扩增的DNA产产 物为物为2n拷贝。拷贝。 热变性热变性-复性复性-延伸延伸25-35 次循环次循环百万倍扩增百万倍扩增目目 录录尽管尽管PCR扩增扩增DNA非常有效，但目的非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。在正常的反应条件下，在正常的反应条件下，3040次循环，酶的次循环，酶的催化反应趋于饱和催化反应趋于饱和-平台效应平台效应 (Plateau)“平台效应平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、出现的迟早还取决于酶的性能、模板模板DNA的拷贝数、的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。浓度等多种因素。循环次数循环次数目目 录录理论上，理论上，n个循环后，产量为个循环后，产量为2n拷贝。拷贝。实际上，实际上，PCR的扩增倍数为（的扩增倍数为（1+X）n， X为扩增效率，平均为为扩增效率，平均为75%目目 录录DNA的体内复制的体内复制PCR原料template DNA（genomic DNA ），RNA primer，dNTPstemplate DNA（genomic DNA ，cDNA），a pair of specific primers，dNTPs酶Topo异构酶，解旋酶，引物酶， DNA聚合酶，连接酶DNA polymease反应条件胞液环境，胞液环境，37 buffer，三种变化的温度（，三种变化的温度（94，50-70，72 ），），cycles（25-35）反应过程起始（模板起始（模板DNA解链、形成引发解链、形成引发体）、延伸、终止（三阶段）体）、延伸、终止（三阶段）反应过程：变性、退火反应过程：变性、退火 、延伸（三阶、延伸（三阶段，多循环）段，多循环）产物模板模板DNA （基因组（基因组DNA）拷贝数）拷贝数增加一倍增加一倍目的目的DNA（特异性）拷贝数增加（特异性）拷贝数增加倍倍目目 录录（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1. 1. 粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目目 录录Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接目目 录录目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录2. 平端连接平端连接目目 录录受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式导入方式转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌目目 录录感受态细胞的制备感受态细胞的制备基因片段（特别是纯化的基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预细胞，通常将受体细胞预先加以处理，如在低温条先加以处理，如在低温条件件 下，用下，用CaCl2（冰浴）（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这提高质粒的转化效率。这种经过预处理、种经过预处理、容易导入容易导入外源核酸外源核酸分子的受体细胞分子的受体细胞被称作被称作“感受态细胞感受态细胞”（competent cell）。）。目目 录录（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等目目 录录( (插入失活法插入失活法) )抗药性标记选择抗药性标记选择目目 录录重组子重组子重组子重组子非重组子非重组子非重组子非重组子非重组子非重组子目目 录录组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNADNA重组体重组体标志补救标志补救目目 录录目目 录录目目 录录 -互补：互补：通过蓝白通过蓝白斑筛选可斑筛选可以筛选、以筛选、鉴定重组鉴定重组子与非重子与非重组子载体组子载体目目 录录提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性转移到转移到NC膜膜与与DNA或或RNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影Southern blotting目目 录录基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤目目 录录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切割目的基因与载体限制酶切割目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 目目 录录表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达目目 录录1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白目目 录录大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌目目 录录目目 录录优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞目目 录录三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系v疾病基因的发现与克隆疾病基因的发现与克隆v生物制药生物制药v基因诊断基因诊断v基因治疗基因治疗v遗传疾病的预防遗传疾病的预防目目 录录（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系（二）生物制药（二）生物制药目目 录录 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂血液因子血液因子VIII颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子促红细胞生成素促红细胞生成素生长因子生长因子(bFGF, EGF)生长素生长素胰岛素胰岛素干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )白细胞介素白细胞介素超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶单克隆抗体单克隆抗体乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗功功 能能抗凝抗凝促进凝血促进凝血剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化治疗侏儒症治疗侏儒症治疗糖尿病治疗糖尿病抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞抗组织损伤抗组织损伤利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗预防乙肝预防乙肝预防霍乱预防霍乱目目 录录目目 录录基因诊断基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断目目 录录标准标准. 能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；. 能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；. 本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;. 便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。目目 录录（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)目目 录录1. 产前诊断产前诊断2. 携带者测试携带者测试3. 症候前诊断症候前诊断4. 遗传病易感性遗传病易感性（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防目目 录录summaryv1. Recombinant DNA technology builds on a few basic techniques: isolation of DNA, cleavage of DNA at particular sequences, ligation of DNA fragments, introduction of DNA into host cells, replication of DNA, and identification of host cells that contain recombinants.v2. A genomic library represents all the DNA of an organism; A cDNA library contains DNA that is complementary to the mRNA from a particular cell or tissue.目目 录录v3. Fragments of DNA generated by restriction endonucleases are incorporated into vectors, which can be plasmids, bacteriophages, viruses, or artificial chromosomes.v4. Cells containing the desired recombinant are identified by screening.v5. Specific DNA sequences can be amplified by the polymerase chain reaction (PCR). 目目 录录1. 基本概念：基本概念：DNA重组技术、限制性核酸内切酶、重组技术、限制性核酸内切酶、回文结构、基因组回文结构、基因组DNA文库、文库、cDNA文库、文库、PCR2. 何谓基因重组技术，简述其基本过程。何谓基因重组技术，简述其基本过程。3. 何谓目的基因，有哪些来源？何谓目的基因，有哪些来源？4. 解释基因载体，哪些解释基因载体，哪些DNA 可作为基因载体？可作为基因载体？(质粒质粒)