医学课件第3章酶

第三章第三章 酶酶(Enzyme)第一节、酶的概念第一节、酶的概念第二节、酶的分类与命名第二节、酶的分类与命名第三节、酶的作用机理第三节、酶的作用机理第四节、酶促反应动力学第四节、酶促反应动力学第五节、酶活性的调节第五节、酶活性的调节第六节、酶的分离提纯与活力测定第六节、酶的分离提纯与活力测定第一节第一节 酶的概念酶的概念一、酶的研究历史一、酶的研究历史1857年，年，Paster提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果，并于，并于1878年提出年提出“酶（酶（Enzyme）”的概念；的概念；19261926年，年，SumnerSumner首次分离出脲酶结晶，证明具有首次分离出脲酶结晶，证明具有蛋白蛋白质质性质性质。 1981-1982年年Cech实验室发现第一个有催化活性的实验室发现第一个有催化活性的天然天然RNA，取名，取名核酶核酶(ribozyme)。1995年还发现了具有催化活性的年还发现了具有催化活性的DNA。1986年，年，Richard Lerrur和和Peter Schaltz运用单克隆抗运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体，体技术制备了具有酶活性的抗体，抗体酶（抗体酶（abzyme）二、二、酶的概念酶的概念n 酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生 物分子，又称为生物催化剂物分子，又称为生物催化剂Biocatalysts n生物体内一切生化反应都需要酶的催化才能进行！生物体内一切生化反应都需要酶的催化才能进行！n酶催化的生物化学反应，称为酶促反应酶催化的生物化学反应，称为酶促反应 n绝大多数的酶都是蛋白质绝大多数的酶都是蛋白质n在酶的催化下发生化学变化的物质为在酶的催化下发生化学变化的物质为底物底物(Substrate)，生成的物质为生成的物质为产物产物（Product）。）。三、酶的催化特征三、酶的催化特征 用量少而催化效率高；用量少而催化效率高； 酶能够改变化学反应的速度，但不能改变化酶能够改变化学反应的速度，但不能改变化学反应平衡。学反应平衡。 酶本身在反应前后不发生变化酶本身在反应前后不发生变化 酶通过降低反应的活化能，从而加速反应的酶通过降低反应的活化能，从而加速反应的进行。进行。1. 酶和一般催化剂的共性酶和一般催化剂的共性2. 2. 酶与一般催化剂的区别酶与一般催化剂的区别高效性高效性高度专一性高度专一性反应条件温和反应条件温和, ,易失活易失活催化活性调控催化活性调控某些酶催化活力与辅因子有关某些酶催化活力与辅因子有关 反应速度与不加催化剂相比可提高反应速度与不加催化剂相比可提高10108 810102020，加，加普通催化剂相比可提高普通催化剂相比可提高10107 710101313酶的催化酶的催化高效性高效性例如：例如：2H2O2 2H2O + O2 Fe3+催化，效率为催化，效率为610-4 mol/molS， 过氧化氢酶催化，效率为过氧化氢酶催化，效率为6106 mol/molS, 比无催高比无催高1081020倍倍(一亿一千亿亿倍一亿一千亿亿倍) 高度专一性高度专一性 通常把被酶作用的物质称为该酶的通常把被酶作用的物质称为该酶的底物底物(substrate);例如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉例如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。的水解；核酸酶催化核酸的水解。酶的专一性酶的专一性(Specificity：酶只能作用于某一化合物：酶只能作用于某一化合物（或结构相似的一类化合物）发生一定的反应。（或结构相似的一类化合物）发生一定的反应。即即酶对底物和所催化的反应都有严格的选择性酶对底物和所催化的反应都有严格的选择性。四、酶的化学本质四、酶的化学本质 酶由酶由C、H、O、N等元素组成，其比例反映了蛋白质的等元素组成，其比例反映了蛋白质的化学组成；化学组成； 酶对热不稳定酶对热不稳定 酶是两性电解质；酶是两性电解质； 凡引起蛋白质变性的物化因素均可导致酶丧失活性；凡引起蛋白质变性的物化因素均可导致酶丧失活性； 酶是亲水胶体；酶是亲水胶体； 酶被蛋白酶水解失活；酶被蛋白酶水解失活； 酶表现蛋白质所特有的显色反应酶表现蛋白质所特有的显色反应 酶经酸碱水解后的最终产物是氨基酸酶经酸碱水解后的最终产物是氨基酸1、大多数酶是蛋白质、大多数酶是蛋白质，主要依据是：，主要依据是：2、核酶、核酶，具有催化活性的，具有催化活性的RNA1、按化学组成分为、按化学组成分为五五. .酶的组成酶的组成结合酶结合酶（全酶）（全酶）酶蛋白酶蛋白专一性和高效性专一性和高效性辅因子辅因子决定反应性质决定反应性质全酶全酶=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子小分子有机物小分子有机物金属离子金属离子:Zn2+，Mg2+，Mn2+，Fe2+或或Fe3+，Cu2+或或Cu 1+辅因子辅因子酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子或某些质部分，其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程。基团的载体参与反应并促进整个催化过程。与酶蛋白结合紧密与酶蛋白结合紧密辅基辅基与酶蛋白结合松弛与酶蛋白结合松弛辅酶辅酶辅因子辅因子羧肽酶Zn离子离子通常一种酶蛋白必须与某一特定的辅酶结合，才通常一种酶蛋白必须与某一特定的辅酶结合，才能成为有活性的酶；而一种辅酶常常可与不同的能成为有活性的酶；而一种辅酶常常可与不同的酶蛋白结合，组成具有不同专一性的全酶。酶蛋白结合，组成具有不同专一性的全酶。2、按结构特点分为：、按结构特点分为：单体酶单体酶只有只有一条肽链的酶。一条肽链的酶。一般是水解酶一般是水解酶寡聚酶寡聚酶由几个或多个亚基组成的酶。由几个或多个亚基组成的酶。多为糖多为糖代谢酶。代谢酶。亚基间非共价结合，解离则失活。有同亚基间非共价结合，解离则失活。有同种亚基寡聚酶和异种亚基寡聚酶之分。种亚基寡聚酶和异种亚基寡聚酶之分。多酶络合物多酶络合物由多种功能相关的酶嵌合而成由多种功能相关的酶嵌合而成的复合物。的复合物。每个单独的酶都具有活性，当它们形每个单独的酶都具有活性，当它们形成复合体时，可催化某一特定的链式反应。有利成复合体时，可催化某一特定的链式反应。有利于系列化学反应的连续进行，提高催化效率，同于系列化学反应的连续进行，提高催化效率，同时便于机体对酶的调控。时便于机体对酶的调控。多酶络合物多酶络合物丙酮酸脱氢酶系丙酮酸脱氢酶系丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶硫辛酸乙酰移换酶硫辛酸乙酰移换酶二氢硫辛酸脱氢二氢硫辛酸脱氢3、根据酶的存在状态：、根据酶的存在状态：胞内酶胞内酶：在合成分泌后定位于细胞内发生：在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶，大多数的酶属于此类。作用的酶，大多数的酶属于此类。胞外酶胞外酶：在合成后分泌到细胞外发生作用的：在合成后分泌到细胞外发生作用的酶，主要为水解酶。酶，主要为水解酶。1) 反应专一性反应专一性:只选择性地催化一种或一类只选择性地催化一种或一类相同类型的化学反应相同类型的化学反应2) 底物专一性底物专一性:只作用于某一种或某一类结只作用于某一种或某一类结构性质相似的物质构性质相似的物质1、酶作用的专一性、酶作用的专一性六、酶的专一性六、酶的专一性键专一性键专一性基团专一性基团专一性旋光异构专一性旋光异构专一性几何异构专一性几何异构专一性立体异构专一性立体异构专一性结构专一性结构专一性绝对专一性绝对专一性相对专一性相对专一性 琥珀酸脱氢酶只作用于琥珀酸，不作用于它的类似物琥珀酸脱氢酶只作用于琥珀酸，不作用于它的类似物 胰蛋白酶可水解胰蛋白酶可水解:Aa1=Lys(Arg)与与Aa2间的肽键间的肽键N HC HCOR4N HC HCOR3N HC HCOR2N HC HCOR1胰蛋白酶胰蛋白酶 L-氨基酸氧化酶：催化氨基酸氧化酶：催化L-AA氧化氧化,不作用于不作用于D-AA 延胡索酸酶延胡索酸酶只能催化延胡索酸，对马来酸则不起作用只能催化延胡索酸，对马来酸则不起作用酯酶：酯酶：R-CO-O-R(对对R和和R不要求不要求)一、酶的分类一、酶的分类b催化生物体内的氧化催化生物体内的氧化-还原反应，涉及还原反应，涉及H或电子的转移或电子的转移b脱氢酶脱氢酶(dehydrogenase)、氧化酶、氧化酶(Oxidase)等等。 AH2 + B = A + BH2b如乳酸如乳酸(Lactate)脱氢酶脱氢酶1、氧化、氧化-还原酶还原酶(Oxidoreductase)CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH第二节、酶的分类与命名第二节、酶的分类与命名2、转移酶、转移酶(Transferase)b催化分子间功能基团的转移催化分子间功能基团的转移 AR + B = A + BRCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO如谷丙转氨酶如谷丙转氨酶3、水解酶、水解酶(Hydrolase)b催化底物的加水分解反应催化底物的加水分解反应b淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及酯酶等。淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及酯酶等。 AB + HOH = AOH + BHH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH 如脂肪酶如脂肪酶(Lipase)(Lipase)4、裂合酶、裂合酶(Lyase)b催化非水解的除去底物分子中的基团催化非水解的除去底物分子中的基团及其逆反应及其逆反应; 有醛缩酶、水化酶及脱氨酶等有醛缩酶、水化酶及脱氨酶等 AB = A + BHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH如：延胡索酸水合酶如：延胡索酸水合酶5、异构酶、异构酶(Isomerase)b催化各种同分异构体的相互转化催化各种同分异构体的相互转化 A=BOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH 如葡萄糖异构酶如葡萄糖异构酶pp6、合成酶、合成酶(Synthetase or Ligase)b(连接酶连接酶)能够能够催化与催化与ATP分解反应相偶分解反应相偶联的由两分子合成一分子的反应。联的由两分子合成一分子的反应。 A + B + ATP = AB + ADP +Pi 如丙酮酸羧化酶如丙酮酸羧化酶 ATP + 丙酮酸丙酮酸 + CO2 草酰乙酸草酰乙酸+ ADP+Pi二、酶的编号二、酶的编号bEC 1. 1. 1. 27 第一大类，氧化还原酶第一大类，氧化还原酶 第一亚类，被氧化基团为第一亚类，被氧化基团为 CHOH CHOH 第一亚亚类，氢受体为第一亚亚类，氢受体为 NADNAD+ + 该酶在此亚亚类中的序号该酶在此亚亚类中的序号酶学委员酶学委员会缩写会缩写乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶三、酶的命名三、酶的命名1 1、国际系统命名法、国际系统命名法系统名称包括底物名称、系统名称包括底物名称、构型构型、反应性质，、反应性质，最后加一个酶字。最后加一个酶字。 例如：例如： 谷氨酸谷氨酸+ +丙酮酸丙酮酸 - -酮戊二酸酮戊二酸+ +丙氨酸丙氨酸 习惯名称：谷丙转氨酶习惯名称：谷丙转氨酶 系统名称：丙氨酸：系统名称：丙氨酸： - -酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶2、习惯命名法、习惯命名法 根据酶作用的底物来命名根据酶作用的底物来命名（蛋白酶；淀粉酶）（蛋白酶；淀粉酶） ； 根据所催化反应的性质来命名根据所催化反应的性质来命名（水解酶；转氨酶；（水解酶；转氨酶；裂解酶等）裂解酶等） ； 结合上述两个原则来命名（乳酸脱氢酶、草酰乙结合上述两个原则来命名（乳酸脱氢酶、草酰乙酸脱羧酶）；酸脱羧酶）； 有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。第三节、酶的第三节、酶的作用机理作用机理活化能：分子由常态变为活化态所需的能量。活化能：分子由常态变为活化态所需的能量。指在一定温度下，指在一定温度下，1mol1mol底物全部进入活化态所需底物全部进入活化态所需要的自由能，单位要的自由能，单位J/molJ/mol。一、酶的催化作用与分子活化能一、酶的催化作用与分子活化能 活化分子活化分子 有效碰撞有效碰撞 化学反应化学反应 反应速度的高低取决于活化分子的数目反应速度的高低取决于活化分子的数目b外加能：外加能：使较多的反应物分子获得所需要使较多的反应物分子获得所需要活化能。活化能。b使用催化剂：降低底物分子所必须具有的使用催化剂：降低底物分子所必须具有的活化能。活化能。q使常态分子变为活化分子的途径：使常态分子变为活化分子的途径：酶降低反应的活化能酶降低反应的活化能反应过程中能的变化反应过程中能的变化n2H2O22H2O+O2n无催化剂无催化剂 E=75.348KJ/mol胶态胶态Pt E=48.976KJ/molnH2O2酶酶 E=8.372KJ/molEAEAEA G 酶能够大幅降低化学反应活化能酶能够大幅降低化学反应活化能反应方向，主要取决于反应自由能变化反应方向，主要取决于反应自由能变化 G 反应速度快慢反应速度快慢, 则主要取决于反应的则主要取决于反应的EA酶能够降低反应酶能够降低反应EA （活化能），从而起到提高（活化能），从而起到提高反应速度的作用。反应速度的作用。酶能降低反应活化酶能降低反应活化能能b无酶参与无酶参与 SP（要求（要求S的自由能高）的自由能高）b有酶参与下有酶参与下 E + S ES E + P一定时间内一定时间内到同一地点到同一地点马拉松马拉松坐车坐车二、中间产物学说二、中间产物学说 酶如何降低化学反应的活化能？酶如何降低化学反应的活化能？ 中间产物学说认为：中间产物学说认为：在酶促反应中，首先酶在酶促反应中，首先酶与底物形成不稳定的与底物形成不稳定的酶底物中间复合物酶底物中间复合物E-SE-S，当底物分子在酶作用下发生化学变化后，当底物分子在酶作用下发生化学变化后，ESES再分解成产物和酶。再分解成产物和酶。 E + S = E-S P + E反应系统反应系统吸收光谱吸收光谱溶液颜色溶液颜色酶酶645、583、548、498 红褐色红褐色加入加入H2O2561、530.5红色红色加入加入AH264.5、583、548、498红褐色红褐色间接实验证实了间接实验证实了ES复合物的存在复合物的存在过氧化物酶过氧化物酶+H2O2 过氧化物酶过氧化物酶H2O2 过氧化物酶过氧化物酶H2O2 +AH2过氧化物酶过氧化物酶 +A+ 2H2O酶酶与与中中间间复复合合物物蔗糖酶蔗糖酶蔗糖蔗糖果糖果糖葡萄糖葡萄糖三三. .酶的活性部位和必需基团酶的活性部位和必需基团活性中心活性中心( (活性部位活性部位):):指酶分子中直接和底指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位物结合，并和酶催化作用直接有关的部位. .活性中心多位于酶活性中心多位于酶分子的表面呈裂缝状分子的表面呈裂缝状b多位于酶分子的表面呈裂缝状多位于酶分子的表面呈裂缝状b只占酶分子总体积的很小一部只占酶分子总体积的很小一部分分b具有三维空间结构具有三维空间结构b由由结合部位和催化部位结合部位和催化部位组成组成b酶的活性部位和底物的辨认和酶的活性部位和底物的辨认和结合过程，称为诱导契合结合过程，称为诱导契合必必需需基基团团维持酶空间构象的其余基团维持酶空间构象的其余基团活活性性中中心心催化部位催化部位结合部位结合部位与底物结合的与底物结合的 部位、部位、决定反应专一性决定反应专一性必需基团：必需基团： 指酶分子中经化学修饰指酶分子中经化学修饰(氧化、还原、酰化、氧化、还原、酰化、烷化等烷化等)改变后，则酶的活性丧失的基团。改变后，则酶的活性丧失的基团。促使底物发生化学反应变促使底物发生化学反应变化的部位、决定催化性质化的部位、决定催化性质酶的催化位点可以不止一个，而结合部位又可分酶的催化位点可以不止一个，而结合部位又可分为若干个亚位点，分别与底物的不同部位结合为若干个亚位点，分别与底物的不同部位结合亲核性基团：亲核性基团： 酶活性中心的必需基团酶活性中心的必需基团H2NCHCCH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNHSer-OHCys-SHHis的咪唑基的咪唑基.H2NCHCCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHOCOHOCOOHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2NH2H2NCHCCH2OHOOHOHAsp和和Glu的羧基的羧基Lys的氨基的氨基Tyr的酚羟基的酚羟基酸碱性基团：酸碱性基团：CysSHHis的咪唑基的咪唑基四、决定酶专一性的机制四、决定酶专一性的机制“锁钥学说锁钥学说”(lock and key thoery) （E.Fischer，1890）底物与酶的结合如同钥匙与锁的关系。即底底物与酶的结合如同钥匙与锁的关系。即底物分子进行化学反应的部位与酶分子活性中物分子进行化学反应的部位与酶分子活性中心具有紧密互补的关系。心具有紧密互补的关系。“诱导契合诱导契合”假说假说(induced-fit hypothesis, D.Koshland,1958）&酶表面不存在与底物互补的固定形状，但酶的活性中酶表面不存在与底物互补的固定形状，但酶的活性中心具有一定的柔性，两者相遇，底物诱导酶活性中心心具有一定的柔性，两者相遇，底物诱导酶活性中心的构象发生相应的变化，使酶和底物契合而结合成中的构象发生相应的变化，使酶和底物契合而结合成中间络合物，并引起底物发生反应。反应结束，产物从间络合物，并引起底物发生反应。反应结束，产物从酶上脱落，酶的活性中心又恢复原来的构象。酶上脱落，酶的活性中心又恢复原来的构象。五、使酶具有高催化效率的因素五、使酶具有高催化效率的因素底物与酶的底物与酶的邻近效应和定向效应邻近效应和定向效应 “张力张力”与与“变形变形”酸碱催化酸碱催化共价催化共价催化活性中心的低介电区域活性中心的低介电区域n普通化学反应：随机碰撞（受浓度、碰撞角度影普通化学反应：随机碰撞（受浓度、碰撞角度影响）响） 自由恋爱自由恋爱n酶的活性中心：酶的活性中心： “婚姻介绍所婚姻介绍所”n邻近作用提高了酶的活性中心（邻近作用提高了酶的活性中心（“婚介婚介”）底物）底物的浓度（的浓度（非婚男女集中非婚男女集中）n定向作用缩短了底物与催化基团间（定向作用缩短了底物与催化基团间（“男女男女”）的距离的距离n提高反应速度（提高反应速度（成功率成功率）108倍倍邻近效应和定向效应邻近效应和定向效应邻近效应和定向效应邻近效应和定向效应 大大提高了酶活性部位大大提高了酶活性部位上底物的有效浓度上底物的有效浓度 分子间反应类似于分子内分子间反应类似于分子内反应，大大提高了酶底络反应，大大提高了酶底络合物进入过渡态的纪律。合物进入过渡态的纪律。 “张力张力”与与“变形变形”底物结合使酶的构象发生变化，而变化底物结合使酶的构象发生变化，而变化的酶分子又使底物分子中的敏感键发生的酶分子又使底物分子中的敏感键发生“张力张力”甚至甚至“变形变形”，使底物分子内，使底物分子内敏感键更易于断裂，促进敏感键更易于断裂，促进ES络合物进络合物进入过渡态。入过渡态。酸碱催化酸碱催化在反应中通过瞬时的向反应物提供质子或从反应在反应中通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，从而加快反应速度物接受质子以稳定过渡态，从而加快反应速度酶分子中广义酸、碱的基团酶分子中广义酸、碱的基团His是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。酸催化酸催化共价催化共价催化定义：催化剂定义：催化剂+ +底物底物反应活性高的不稳定共反应活性高的不稳定共价中间物价中间物反应活化能降低反应活化能降低提高反应速度提高反应速度基团主要基团主要:亲核基团：亲核基团： His -咪唑基，咪唑基，Cys -SH，Asp -COOH，Ser-OH等等亲电基团：亲电基团：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。醛等也可以参与共价催化作用。活性中心的低介电区域活性中心的低介电区域b指酶的活性部位催化基团所处的微小环境；指酶的活性部位催化基团所处的微小环境；b酶活性中心一般是处于一个非极性环境中，酶活性中心一般是处于一个非极性环境中，有利于同底物的结合，并使底物的敏感键和有利于同底物的结合，并使底物的敏感键和酶的催化基团之间有较大的反应力；酶的催化基团之间有较大的反应力；酶催化机理实例酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶1. 胰凝乳蛋白酶结构胰凝乳蛋白酶结构2. 胰凝乳蛋白酶的电荷接力网胰凝乳蛋白酶的电荷接力网A.酶与底物结合，形成米氏复合物（酶与底物结合，形成米氏复合物（ES）B.形成四联体过度态中间物形成四联体过度态中间物3. 胰凝乳蛋白酶的催化过程胰凝乳蛋白酶的催化过程E.形成包括水分子的四联体过度中间物形成包括水分子的四联体过度中间物F.羰基产物形成，酶游离羰基产物形成，酶游离酶原（酶原（Zymogen）：）：在细胞内合成时或初在细胞内合成时或初分泌时，无活性状态的酶的前体称为酶原分泌时，无活性状态的酶的前体称为酶原酶原的激活：在一定条件下，酶原转化成有酶原的激活：在一定条件下，酶原转化成有活性的酶的过程。活性的酶的过程。酶原激活的机制：酶原激活的机制：酶的活性中心形成或曝露酶的活性中心形成或曝露的过程的过程.六、酶原六、酶原(zymogen/proenzyme)的激活的激活缬缬 天天 天天天天天天赖赖缬缬 甘甘组组缬缬 天天 天天天天天天赖赖甘甘 组组SS缬缬SS活性中心活性中心胰胰蛋蛋白白酶酶原原胰胰蛋蛋白白酶酶胰蛋白酶原肠激酶胰蛋白酶+六肽胰凝乳蛋白酶原胰蛋白酶-凝乳蛋白酶+两个二肽羧基肽酶原胰蛋白酶羧 基肽酶 A+几个碎片 酶原激活还存在级联反应。酶原激活还存在级联反应。 酶原形式存在的生物学意义：酶原形式存在的生物学意义：保护组织细胞，防止被酶水解保护组织细胞，防止被酶水解; ;有机体调控酶活的一种方式。有机体调控酶活的一种方式。第四节、酶促反应动力学第四节、酶促反应动力学 酶促反应速度的测定酶促反应速度的测定 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响 酶浓度对酶促反应速度的影响酶浓度对酶促反应速度的影响 pHpH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响 温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响 激活剂对酶促反应速度的影响激活剂对酶促反应速度的影响 抑制剂对酶促反应速度的影响抑制剂对酶促反应速度的影响 反应速度反应速度(velocity)：单位时间内底物的消：单位时间内底物的消耗量或产物的生成量。耗量或产物的生成量。 一、酶促反应速度的测定一、酶促反应速度的测定底物的消耗量或产物的生成量哪个表示反应速度更准确？为什么底物的消耗量或产物的生成量哪个表示反应速度更准确？为什么答：产物的生成量。答：产物的生成量。测定反应速度时，底物浓度往往是过量的，反应时底物减测定反应速度时，底物浓度往往是过量的，反应时底物减少的量只占其总量的极少部分，测定时不易准确。少的量只占其总量的极少部分，测定时不易准确。 而产物是从无到有，只要方法足够灵活，就可以准确测而产物是从无到有，只要方法足够灵活，就可以准确测定。定。酶促反应速度的测定方法酶促反应速度的测定方法提问：为什么反应速度提问：为什么反应速度会随时间减小？会随时间减小？S降低；降低；逆反应增大逆反应增大酶失活酶失活酶受到产物抑制酶受到产物抑制提问：用哪一个速度来提问：用哪一个速度来表示表示该酶促反应的速度该酶促反应的速度特征呢？特征呢？产物浓度变化曲线产物浓度变化曲线反应初速度反应初速度 Vo反应反应初初速度表示酶活力速度表示酶活力初速度初速度(initial velocity)：底物被消耗：底物被消耗5%以内的酶促反应速度。以内的酶促反应速度。二二. .底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响E + S ES P + Ek1K-1k2E、S、ES、P分别为酶分别为酶E、底物、底物S、酶底中间物酶底中间物ES、产物、产物P的浓度。的浓度。Et为总酶为总酶浓度浓度1、底物浓度对酶反应速度的影响、底物浓度对酶反应速度的影响k1 、k2 、k-1为各反为各反应的速度常数应的速度常数E + S ES P + Ek1K-1k2VV VV V/ /2 2 0 Km （ 米米 氏氏 常常 数数 ） S最最大大反反应应速速率率混合级混合级一级反应一级反应零级反应零级反应2.2.米式方程的理论假定米式方程的理论假定测定的速度为初速度；测定的速度为初速度；SE;SE;ESES的生成速度和的生成速度和ESES的分解速度相等的分解速度相等 121kkkESSESSEt令令：Kmkkk121将将（4）代入代入（3），则，则： SKSVvmmax1kES 1kES2kEP ESEt SESES生成速度生成速度： SESEkvt11，ES分解速度分解速度：ESkESkv212即即： ESkESkSESEkt211则则： SSESESKmtE(1)经整理得经整理得： SKSEmtES由于酶促反应速度由由于酶促反应速度由ES决定，即决定，即ESkv22kvES，所以所以(2)将将（2）代入代入（1）得得： SKSEkvmt2 SKSEkmt2v(3)当酶反应体系处于当酶反应体系处于恒态恒态时时：21vv 当当Et=ES时时，mVv tmEkV2(4)所以所以 恒恒态态法法P84 V V0 底底 物物 浓浓 度度 S反反应应初初速速度度V= VmaxSKm + SVV VV/2V/2 0 Km （米氏常数）（米氏常数） S最最大大反反应应速速率率b当当S Km v=VmaxS/Km 一级反应一级反应b当当S Km v=VmaxS/S=Vmax 0 级反应级反应混合级混合级4、米氏常数、米氏常数KmVmax2Vmax SKm + SKm + S = 2SKmS若若 vVmax/2v= V VmaxSKm + SKm=？v v =1/2 Vmax, =1/2 Vmax, K Km =S m =S ，即米氏常数是反应速度为最大速度一半时的底物浓度。即米氏常数是反应速度为最大速度一半时的底物浓度。Km的单位为的单位为mol/L。5、米氏常数、米氏常数Km的意义的意义Km是反应速度为最大速度一半时的底物浓度是反应速度为最大速度一半时的底物浓度Km是酶的特征物理常数；是酶的特征物理常数；不同的酶具有不同不同的酶具有不同Km值；值；同一种酶的不同的底物有不同同一种酶的不同的底物有不同Km值，其中值，其中Km值最小的底物为最适底物；值最小的底物为最适底物；Km值可近似表示酶与底物之间的亲和力：值可近似表示酶与底物之间的亲和力：Km值大表示亲和力小，酶的催化活性低值大表示亲和力小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和力大，酶的催化活性高。值小表示亲和力大，酶的催化活性高。v Km大小表示酶对底物的亲和力大小大小表示酶对底物的亲和力大小E + S ES P + Ek1K-1k2当当k1 、k2 k-1时时,Km= k2 + k-1 k1kmk2（分离能力）（分离能力）/k1（亲合能力（亲合能力) Km越小，亲和力越强越小，亲和力越强，因为底物浓度，因为底物浓度很小时，反应速度就能达到很大，性很小时，反应速度就能达到很大，性能优，代谢中这类酶更为重要。能优，代谢中这类酶更为重要。Km与酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶与酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶6、Km值与米氏方程的实际用途值与米氏方程的实际用途根据反应速度，求出应加入底物的合理浓度；根据反应速度，求出应加入底物的合理浓度；根据底物浓度，求出该条件下的反应速度。根据底物浓度，求出该条件下的反应速度。例如：例如：1. 要求要求v=99%Vmax,则则S应为应为?S=99Km99%Vmax Vmax S Km + Sv=2. 当当S=1/2Km时，求反应速度为最大速度的多少？时，求反应速度为最大速度的多少？v=1/3Vmaxs （mmol/L） V （mol/Lmin） s （mmol/L） V （mol/Lmin） 2.510-6 24 2.010-5 80 3.3310-6 30 4.010-5 96 4.010-6 34 1.010-4 109 5.010-6 40 2.010-3 119 1.010-5 60 1.010-2 120 n证明该酶促反应遵循米氏方程。证明该酶促反应遵循米氏方程。nKm和和Vmax各多少？各多少？7、米氏常数、米氏常数Km的求法的求法 1V=Km V 1S+ 1VV= VSKm + S取倒数取倒数 1/V 1/V V -1/Km 0 1/S以以1/V 1/S作图作图( Y=aX+b )纵截距纵截距=1/V横截距横截距=-1/Km三、三、酶浓度对酶促反应速度的影响酶浓度对酶促反应速度的影响v = Vmax S Km + S K2 SKm + SE=v与与E成正比关系（成正比关系（S足够大，足够大，v=K2E）EVS Km四四.pH.pH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响在一定的在一定的pHpH下下, , 酶具有最大的酶具有最大的催化活性催化活性, ,通常通常称此称此pHpH为最适为最适pHpH。一般酶的一般酶的最适最适pHpH为为6-86-8。胃蛋白酶胃蛋白酶1.9精氨酸酶精氨酸酶9.7 酶的最适酶的最适pH不是酶的特征常数不是酶的特征常数qpHpH影响酶促反应速度的原因影响酶促反应速度的原因 pH太大或太小使酶变性使活；太大或太小使酶变性使活； pH影响底物的解离状态影响底物的解离状态; pH影响酶活性部位有关基团的解离；影响酶活性部位有关基团的解离； pH影响酶的其余必需基团影响酶的其余必需基团 最适温度最适温度动物酶动物酶 3540植物酶植物酶 4050微生物微生物 大部分大部分 4050个别高温菌个别高温菌 100以上以上达最适温度之前，随温度升高达最适温度之前，随温度升高,酶促反应酶促反应速度加快速度加快,Q10=12；达最适温度之后，如温度再升高达最适温度之后，如温度再升高,随着酶随着酶的变性失活，活性酶的含量减少，反应的变性失活，活性酶的含量减少，反应速度随之降低；速度随之降低； 温度对酶促反应速度的影响是以上两种温度对酶促反应速度的影响是以上两种相反作用的综合结果相反作用的综合结果 酶若制成干粉，可放置在室温下保存，酶若制成干粉，可放置在室温下保存，而处于溶液状态时必须放在冰箱里保存。而处于溶液状态时必须放在冰箱里保存。实际应用实际应用贮存酶制剂贮存酶制剂大多数酶都有一个最适温度，在最适温度条大多数酶都有一个最适温度，在最适温度条件下件下, ,反应速度最大。反应速度最大。酶的最适温度不是固定不变的常数。酶的最适温度不是固定不变的常数。六六. .激活剂激活剂对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响无机离子无机离子( 金属离子：如金属离子：如Mg2+、阴离子：如、阴离子：如Cl-)有机分子有机分子（-SH酶的还原剂；金属螯合剂；）酶的还原剂；金属螯合剂；）蛋白质（如肠激酶对胰蛋白酶的激活）蛋白质（如肠激酶对胰蛋白酶的激活）凡能提高酶活力的物质都称为酶激活剂。凡能提高酶活力的物质都称为酶激活剂。酶分子中的金属离子酶分子中的金属离子如如 Fe2+/ Fe3+ 、Cu+/Cu3 、Zn2+ 、Mn2+、Co2 等等是是酶的辅助因子，与酶蛋白酶的辅助因子，与酶蛋白的结合紧密的结合紧密。当金属离子如当金属离子如NaNa+ + 、K K+ +、 MgMg2+2+、 CaCa2+2+ 等是酶的激等是酶的激活剂时，与酶的结合一般较松散，在溶液中活剂时，与酶的结合一般较松散，在溶液中, ,酶与酶与这类离子结合而被激活。这类离子结合而被激活。七七. .抑制剂抑制剂对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响酶的失活酶的失活：因酶蛋白变性而引起酶活力丧失的现象：因酶蛋白变性而引起酶活力丧失的现象酶的抑制作用：酶的抑制作用：因酶蛋白必需基团化学性质的改变而因酶蛋白必需基团化学性质的改变而引起酶活力下降或丧失的作用引起酶活力下降或丧失的作用。能够引起酶的抑制作用的化合物称为能够引起酶的抑制作用的化合物称为抑制剂。抑制剂。 酶的抑制剂的特点：酶的抑制剂的特点：在化学结构上与底物分子或底物在化学结构上与底物分子或底物的过渡状态相似的过渡状态相似与酶活性中心以非共价或共价的与酶活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。方式形成比较稳定的复合体。抑制剂与酶的作用方式抑制剂与酶的作用方式不可逆抑制不可逆抑制 竞争性抑制竞争性抑制可逆抑制可逆抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制 反竞争性抑制反竞争性抑制（一）、不可逆抑制作用（一）、不可逆抑制作用定义：抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价定义：抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活；二者结合以形式结合，引起酶的永久性失活；二者结合以后不能用透析等方法除去抑制剂而恢复酶的活后不能用透析等方法除去抑制剂而恢复酶的活力。力。多为多为剧毒剧毒物质物质（二异丙基氟磷酸）（二异丙基氟磷酸）乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶胆碱胆碱酯酶酯酶OHPOC2H5OC2H5S有机磷农药有机磷农药神经传导神经传导中毒！中毒！+(CH3)3N+CH2CH2OCOCH3(CH3)3N+CH2CH2OH +CH3COOHH2O胆碱乙酰化酶胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱胆碱乙酰胆碱乙酰胆碱 有机磷农药抑制胆碱酯酶活性有机磷农药抑制胆碱酯酶活性 乙酰胆碱乙酰胆碱的堆积的堆积 神经过度兴奋神经过度兴奋 抽搐而死抽搐而死（二）、可逆抑制作用（二）、可逆抑制作用v定义：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，定义：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶的暂时性失活；引起酶的暂时性失活；可以用可以用透析等方法透析等方法除去抑制剂而恢复酶的活力。除去抑制剂而恢复酶的活力。 v根据抑制剂与底物的关系，可逆抑制可为：根据抑制剂与底物的关系，可逆抑制可为：竞争性抑制、非竞争性抑制竞争性抑制、非竞争性抑制 反竞争性抑制反竞争性抑制1 1、竞争性抑制、竞争性抑制定义：定义：I I的化学结构与的化学结构与S S相似，因而能与底相似，因而能与底物竟争结合酶活性中心。当抑制剂与活性物竟争结合酶活性中心。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。其结果是酶促反应被抑制了。竞争性抑制通常竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。即提高底物的竞争能力来消除。E+SES E+P+IEIu竞争性抑制的动力学方程式竞争性抑制的动力学方程式有竞争性抑制剂存在时，有竞争性抑制剂存在时，Km值增大值增大(1+I/Ki)倍，且倍，且Km值随值随I的增高而增大；的增高而增大；在在E固定时，当固定时，当S Km (1+I/Ki), Km (1+I/Ki)项可忽略不计，项可忽略不计， 则则v= Vmax，即最大反应速度不变。，即最大反应速度不变。无抑制剂无抑制剂竞争性抑制剂竞争性抑制剂有抑制剂有抑制剂Km变大变大Vmax不变不变加竞争性抑制剂，加竞争性抑制剂，Km变大，变大，Vmax不变不变竞争性抑制剂的应用：磺胺类药物的治病机制竞争性抑制剂的应用：磺胺类药物的治病机制2 2、非竞争性抑制、非竞争性抑制u非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用E+SES E+P+IEI+SESI+I I既可与既可与E结合，又可与结合，又可与ES结合，结合，EI和和ESI都是失活的复合物，都是失活的复合物，ESI不能转变为产物不能转变为产物 非竞争性抑制剂的结合部位为酶活性中心非竞争性抑制剂的结合部位为酶活性中心以外的必需基团以外的必需基团 如如EDTA、F- 、CN-等金属络合剂可与金属酶中等金属络合剂可与金属酶中的金属离子络合使酶活性受抑制的金属离子络合使酶活性受抑制有非竞争性抑制剂存在时，有非竞争性抑制剂存在时，V V值减小值减小(1+I/Ki)(1+I/Ki)倍，且倍，且V V值随值随II的增高而降低；的增高而降低；KmKm值不变。值不变。加非竞争性抑制剂，加非竞争性抑制剂，Km不变，不变，Vmax 减小。减小。有抑制剂有抑制剂Km不变不变Vmax变小变小bE只有与只有与S结合后才能与结合后才能与I结合，形成结合，形成不不能分解的能分解的ESI三元中间产物，导致酶促反三元中间产物，导致酶促反应被抑制应被抑制。有反竞争性抑制剂存在时，有反竞争性抑制剂存在时，Km和和V值均减值均减小小(1+I/Ki)倍，且都随倍，且都随I的增高而降低。的增高而降低。（1）Km减小，减小，ES亲和力增强亲和力增强（2）Vmax减小减小类类 型型公公 式式VmaxKm无抑制剂无抑制剂(正常）正常）V = VmaxS/(Km+S)VmaxKm竞争性抑制剂竞争性抑制剂 V = VmaxS/Km(1+I/Ki)+S不变不变 增加增加非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂V= VmaxS/(Km+S)(1+I/Ki)减小减小 不变不变反竞争性抑制剂反竞争性抑制剂V =VmaxS/Km+(1+I/Ki )S)减小减小 减小减小抑制类型抑制类型 Vmax Km 无抑制剂无抑制剂 Vmax Km 竞争性抑制竞争性抑制 不变不变 变大变大 非竞争性抑制非竞争性抑制 变小变小 不变不变 反竞争性抑制反竞争性抑制 变小变小 变小变小 第五节、第五节、酶活性的调节酶活性的调节 1、基本概念基本概念：某些酶的相应部位与底物或底物以外某些酶的相应部位与底物或底物以外的物质非共价结合后，能改变其自身的分子构象的物质非共价结合后，能改变其自身的分子构象从而影响酶本身的活性，这些酶称变构酶从而影响酶本身的活性，这些酶称变构酶.当底物或效应物与变构酶分子上相应的部位结合后，引起当底物或效应物与变构酶分子上相应的部位结合后，引起酶分子构象改变从而影响酶的催化活性，这种现象称为变酶分子构象改变从而影响酶的催化活性，这种现象称为变构效应（别构效应）构效应（别构效应）allosteric effect同促效应（底物）和异促效应（效应物）同促效应（底物）和异促效应（效应物）一一. .别构酶别构酶( (变构酶变构酶allosteric enzyme) )2、别构酶的主要特征、别构酶的主要特征1）别构酶是寡聚酶）别构酶是寡聚酶 2）别构酶分子上有活性中心）别构酶分子上有活性中心(active site)和别和别构中心构中心(allosteric site)或调节中心或调节中心3）别构酶具有别构效应，引起别构效应的物）别构酶具有别构效应，引起别构效应的物质称效应物质称效应物 (别构激活剂；别构抑制剂）别构激活剂；别构抑制剂）4）别构酶具有协同效应）别构酶具有协同效应5）别构酶的动力学特征不符合米氏方程）别构酶的动力学特征不符合米氏方程酶的一个亚基结合了底物酶的一个亚基结合了底物( (或效应物或效应物) )后后, ,会使其他尚未结合底物会使其他尚未结合底物( (或效应物或效应物) )的亚的亚基对底物的亲和力发生影响基对底物的亲和力发生影响, ,这种越过亚这种越过亚基的相互作用称为协同效应。基的相互作用称为协同效应。正协同效应（促进）正协同效应（促进）负协同效应（抑制）。负协同效应（抑制）。q别构酶具有协同效应别构酶具有协同效应3 3、别构酶的动力学特征、别构酶的动力学特征1.米氏酶：米氏酶：vS为双曲线为双曲线2.正协同效应别构酶：正协同效应别构酶：vS为为S型曲线型曲线3.负协同效应别构酶：负协同效应别构酶：vS为表观双曲线为表观双曲线二、同工酶二、同工酶(Isoenzyme)v定义：催化同一种化学反应定义：催化同一种化学反应, 但其分子形式但其分子形式有所不同的一组酶有所不同的一组酶；v分子组成与结构不同导致同工酶理化性质和分子组成与结构不同导致同工酶理化性质和免疫学性质不同；免疫学性质不同；v它们的活性部位在结构上相同或者至少相似它们的活性部位在结构上相同或者至少相似; v多数为寡聚酶多数为寡聚酶，如乳酸脱氢酶，如乳酸脱氢酶(LDH) 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH):由由H（B）或）或M（A）两种）两种亚基组成的四聚体。五种同工酶，亚基组成的四聚体。五种同工酶，LDH1（H4）、）、LDH2（H3M）、）、LDH3（H2M2）、）、LDH4（HM3）、）、LDH5（M4），它们向正极泳动的速），它们向正极泳动的速度由度由LDH1LDH5依次递减，可藉此分离。依次递减，可藉此分离。乳酸+NAD+丙酮 酸+NADH+H+乳酸脱氢酶用途用途：存在组织特异性，可通过其组：存在组织特异性，可通过其组成和浓度变化诊断疾病成和浓度变化诊断疾病 心脏疾病心脏疾病 LDH1、LDH2上升，上升，LDH3、LDH5下降下降 急性肝炎急性肝炎 LDH5明显上升明显上升三三. .诱导酶诱导酶( (适应酶适应酶) )根据酶的合成与代谢物的关系，把酶分为根据酶的合成与代谢物的关系，把酶分为结构酶结构酶和和诱导酶诱导酶; ;结构酶：结构酶：细胞中天然存在，含量稳定，受外细胞中天然存在，含量稳定，受外界影响小的受基因调控的酶叫；界影响小的受基因调控的酶叫；诱导酶：诱导酶：在多数情况下含量较少，但在底物在多数情况下含量较少，但在底物或底物类似物的诱导下急剧增多的酶叫。或底物类似物的诱导下急剧增多的酶叫。如如 微生物中的半乳糖苷酶微生物中的半乳糖苷酶四、酶活性的化学修饰调节：四、酶活性的化学修饰调节：以共价键形式连接一个基团或去掉此基以共价键形式连接一个基团或去掉此基团使活性改变。团使活性改变。类型：磷酸化类型：磷酸化/去磷酸化、乙酰化去磷酸化、乙酰化/去乙酰化、甲基去乙酰化、甲基化化/去甲基化、腺苷化去甲基化、腺苷化/去腺苷化、糖基化去腺苷化、糖基化/去糖基化去糖基化五、酶分子的聚合或解聚五、酶分子的聚合或解聚六、酶原的激活六、酶原的激活第六节、第六节、酶的分离提纯与活力测定酶的分离提纯与活力测定一、酶活力测定一、酶活力测定1、测定酶活力时应注意、测定酶活力时应注意1）测定反应初速度）测定反应初速度2）维持一整套固定条件（一般选择最）维持一整套固定条件（一般选择最适适pH，过量底物和一定的温度）。，过量底物和一定的温度）。2、酶活力单位、酶活力单位(active unit)v一定条件下，一定条件下，1分钟内转化分钟内转化1mol底物底物的酶量的酶量一个酶活力单位一个酶活力单位(U)vkat：一定条件下，：一定条件下，1秒钟转化秒钟转化1mol底底物所需的酶量物所需的酶量v1kat=6107U 1U=16.67nkat3、酶的比活力、酶的比活力(specific activity)v酶的比活力：指每单位质量样品中的酶的比活力：指每单位质量样品中的 酶活力单位数酶活力单位数v酶的比活力酶的比活力=活力单位数活力单位数/ /毫克酶蛋白毫克酶蛋白 = =总活力单位数总活力单位数/ /总蛋白总蛋白酶的分离提纯步骤及测定记录酶的分离提纯步骤及测定记录步骤步骤 总体积总体积 蛋白质总量蛋白质总量 蛋白质浓度蛋白质浓度 酶活力酶活力 总活力总活力 比活力比活力 (ml) (mg) (mg/ml) (单位单位/ml) (单位单位) (单位单位/mg蛋白蛋白)粗提液粗提液 1000 12000 550变性变性 1000 8000 4.8分级沉淀分级沉淀 250 750 11.0 离子交换离子交换 25 225 88.0其它步骤其它步骤 4 3 37.5计算方法计算方法 128390.75蛋白质总量蛋白质总量/ /总体积总体积5000480027502200150总体积总体积酶活力酶活力0.40.63.79.850总活力总活力蛋白质总量蛋白质总量4、酶的催化常数、酶的催化常数(catalytic constant, Kcat)v当当SKm, v=Vmax=K2*Etvk2表示酶被底物完全饱和时，单位时间内每酶被底物完全饱和时，单位时间内每个酶分子所能转换的底物分子数个酶分子所能转换的底物分子数, 这个常数这个常数又叫做转换数，通称为催化常数又叫做转换数，通称为催化常数kcat，vKcat：Kcat=Vmax/Etvkcat值越大，表示酶的催化效率越高值越大，表示酶的催化效率越高。二、二、 酶的制备酶的制备生物提取生物提取蛋白质提取，蛋白质提取，采用保持采用保持活性的分离法活性的分离法盐析、透析、色谱、电盐析、透析、色谱、电泳等泳等通常方法：通常方法：离心分离离心分离硫酸铵盐析硫酸铵盐析透析透析凝胶过滤凝胶过滤离子交换离子交换酶工程酶工程酶工程酶工程酶制剂在工业酶制剂在工业上的大规模生产及应用上的大规模生产及应用；分分普通酶工程、化学酶普通酶工程、化学酶工程、生物酶工程工程、生物酶工程普通普通单纯生物提取单纯生物提取b例如例如 b淀粉酶经化学修饰连接上葡聚糖后，热稳定性增淀粉酶经化学修饰连接上葡聚糖后，热稳定性增加，使用寿命延长了加，使用寿命延长了30倍；倍；b酶的固定化酶的固定化b化学合成酶由于难度大，产品活性低，发展缓慢化学合成酶由于难度大，产品活性低，发展缓慢固定化优点：稳定性提高，酶易于分离重复使用。固定化优点：稳定性提高，酶易于分离重复使用。A、化学酶工程、化学酶工程：对天然酶进行：对天然酶进行化学修饰化学修饰、固定化固定化处理处理，甚至，甚至化学合成化学合成等手段来改善酶性能的方法；等手段来改善酶性能的方法；B.生物酶工程生物酶工程b利用利用DNA重组技术重组技术改造和生产酶的工程方法。改造和生产酶的工程方法。外源酶基因外源酶基因