第十章重组DNA技术

第第 十十 章章目目 录录第第 一一 节节自然界的自然界的DNA的重组的重组 DNA RecombinationDNA重组重组细菌的基因转移与重组细菌的基因转移与重组接合作用、转化作用、转导作用接合作用、转化作用、转导作用转座重组转座重组 （自学）（自学）同源重组同源重组特异位点的重组（自学）特异位点的重组（自学）发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组，又称又称基本重组基本重组。是最基本的。是最基本的DNA重组方式，重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。源序列间进行单链或双链片段的交换。 以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组的同源重组为例，了解同源重组机制的机制的Holliday模型。模型。一、同源重组一、同源重组Holliday模型中，同源重组主要模型中，同源重组主要4个关键步骤个关键步骤 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐排列整齐一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 目目 录录片段重组体片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本双链区的两侧来自不同亲本DNA。 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目目 录录二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组接合作用接合作用转化作用转化作用转导作用转导作用细胞融合细胞融合（一）接合作用（一）接合作用当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌），这种（细菌），这种DNA转移称为转移称为接合作用接合作用。质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor) （二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为称为转化作用转化作用 。 例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。（三）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的细胞（供体）释放出当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来、再次感染另一细胞（受体）时，发生在来、再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间的供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因转移及基因重组即为重组即为转导作用转导作用。噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径溶源菌生长途径溶源菌生长途径例例目目 录录目目 录录第第 二二 节节 基因工程基因工程DNA Recombination Technique 重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传工遗传工程公司，专门应用重组程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉n相关概念相关概念nDNA克隆克隆n工具酶工具酶n目的基因目的基因n基因载体基因载体n基本原理基本原理 n重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系主要内容主要内容克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆 即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我接合成一具有自我复制能力的复制能力的DNA分子分子复制子，继而通过转化复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。分子。 也称也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA 。 生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n DNA聚合酶聚合酶n 逆转录酶逆转录酶n T4DNA连接酶连接酶n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶n Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(RE)是是识别识别DNA的特异序的特异序列列, 并在识别位点或其周围切割双链并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内的一类内切酶。切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰修饰系统，限制外源系统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口同功异源酶同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同尾酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为称为同尾酶同尾酶。这两个相同的粘性末端称为。这两个相同的粘性末端称为配配伍未端伍未端。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A（三）目的基因（三）目的基因n cDNAn基因组基因组DNA目的基因目的基因 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。载体的选择标准载体的选择标准n能自主复制；能自主复制；n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；n有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；n分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。1. 1. 质粒质粒 (plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息些遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2. 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列M13噬菌体pUC系列的物理图谱3. 粘性质粒粘性质粒(cosmid)酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理克隆基本过程克隆基本过程目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第（见第22章）章） * 1、化学合成法获取目的基因、化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合* 2、从基因组、从基因组DNA文库获取目的基因文库获取目的基因目目 录录（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建若将外源基因连接到复制子(基因载体)上,外源DNA就可以作为复制子的一部分在受体细胞内复制.在基因克隆中基因载体的选择与构建是一项技术性很强的工作,直接影响到基因克隆的成败.（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1. 1. 粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接目目 录录 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A不同限制酶切位点（配伍末端）的连接不同限制酶切位点（配伍末端）的连接配伍末端的连接情况和同一限制酶切位配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。点连接相似。不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录2. 平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录4. 4. 人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目目 录录受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌（从大肠杆菌（从大肠杆菌K-12改造）改造）限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态导入方式导入方式转化转化 转染转染 感染感染（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等( (插入失活法插入失活法) )抗药性标记选择抗药性标记选择目目 录录 互补互补目目 录录 互互补补的的检检测测目目 录录原原位位杂杂交交目目 录录Southern印迹印迹目目 录录鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出目目 录录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌目目 录录优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、不经济操作技术难、费时、不经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱目目 录录目目 录录（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系（二）生物制药（二）生物制药 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂血液因子血液因子VIII颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子促红细胞生成素促红细胞生成素生长因子生长因子(bFGF, EGF)生长素生长素胰岛素胰岛素干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )白细胞介素白细胞介素超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶单克隆抗体单克隆抗体乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗功功 能能抗凝抗凝促进凝血促进凝血剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化治疗侏儒症治疗侏儒症治疗糖尿病治疗糖尿病抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞抗组织损伤抗组织损伤利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗预防乙肝预防乙肝预防霍乱预防霍乱目目 录录基因诊断基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断标准标准. 能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；. 能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；. 本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;. 便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)1. 产前诊断产前诊断2. 携带者测试携带者测试3. 症候前诊断症候前诊断4. 遗传病易感性遗传病易感性（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防目目 录录转基因技术转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。 转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物( (transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物转基因技术转基因技术目目 录录目目 录录目目 录录n转基因动物是动物整体水平研究目的基转基因动物是动物整体水平研究目的基因的生物技术，特点是因的生物技术，特点是“分子及其细胞分子及其细胞水平的操作，组织及动物整体水平表达水平的操作，组织及动物整体水平表达”目目 录录 转基因动物构建过程转基因动物构建过程n转基因载体的构建n将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干细胞n将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫中n对转基因动物进行鉴定目目 录录 转基因的技术方法转基因的技术方法nDNA显微注射法n克隆法n胚胎干细胞技术n逆转录病毒介导的基因转移n精子载体法等各有优点和缺点，常用的是显微注射和克隆法目目 录录 转基因动物的鉴定转基因动物的鉴定nSouthern杂交 确定外源基因的整合以及整合的拷贝数nRT-PCR 确定外源基因的转录和转录水平nWestern杂交 确定外源基因蛋白质的表达情况n实时PCR（荧光定量PCR）目目 录录 转基因技术的应用转基因技术的应用n（1）建立致病基因表达、调控的动物模型n（2）动植物新品种的培育n（3）各种基因工程产品的制备n（4）探讨生殖细胞的基因治疗方法目目 录录 目目 录录核转移技术核转移技术 即即动物整体克隆技术动物整体克隆技术，将动物体细胞，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆使之发育成个体，即克隆( (clone)。这样的个体所携带的性状仅来自一个这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或母亲个体父亲或母亲个体, ,为无性繁殖为无性繁殖. .19961996年年, ,克隆羊克隆羊”多莉多莉”的产生成为当的产生成为当年分子生物学发展最重要的事件年分子生物学发展最重要的事件核转移技术核转移技术目目 录录 克隆羊克隆羊“目目 录录目目 录录基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向( (gene targeting) )灭活，灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。有目的去除动物体内某种基因的技术。基因剔除技术基因剔除技术目目 录录 基因剔除程序基因剔除程序n将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使这一灭活的基因通过同源重组取代原有目的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过显微注射到小鼠囊胚.n细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除小鼠.目目 录录 基因转移和基因剔除技术在基因转移和基因剔除技术在医学中的应用医学中的应用建立动物疾病可遗传的模型建立动物疾病可遗传的模型, ,探讨疾病发生机制探讨疾病发生机制 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 进行基因剔除以模拟基因失活进行基因剔除以模拟基因失活. .单基因疾病模型单基因疾病模型: :地中海贫血地中海贫血, ,动脉硬化动脉硬化, ,老年痴呆等老年痴呆等 多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型 多基因疾病模型多基因疾病模型: :肿瘤肿瘤, ,高血压高血压, ,糖尿病糖尿病