硕士论文DEHP对大鼠哮喘模型的影响及其机理研究

华中师范大学硕士学位论文DEHP对大鼠哮喘模型的影响及其机理研究姓名：郑宇铎申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：杨旭20100501硕士学位论文使大鼠哮喘症状出现了恶化、恶化大鼠哮喘的可能机制致敏引起的是典型的过敏反应引发的哮喘，本身则不能引发健康大鼠的哮喘症状。根据过敏体质学说，过敏性哮喘的主要病理学特征是“气道变应性炎症其发生需要过敏原（）运敏体质（）两种致病因素的联合作用，缺一不可。不是过敏原，对哮喘的作用也不能用传统的过敏原理论解释。但是对哮喘症状的加剧，说明其可以与这一过程中的某些因素起作用，很有可能对过敏体质的产生起作用。也就是说可以使身体对过敏原的刺激更加敏感，进而表现出由过敏原引起的哮喘症状进一步恶化，这种因为外界因素产生的过敏体质被称为获得性过敏体质，而能够引起获得性过敏体质的物质称为过敏体质激发原。本次实验的结果支持了这一理论，可能正是通过充当过敏体质激发原的作用从而恶化哮喘症状的。具体来说平滑肌细胞肥大和过度生长目前被认为是引起气道重塑进而引起气道高反应性这一典型哮喘症状的主要原因。引起气道平滑肌细胞过度生长的正是哮喘病症中其他细胞释放的细胞因子和化学因子，提高气道平滑肌细胞对这些因子的敏感性，从而进一步加快气道平滑肌细胞增殖可能是恶化哮喘症状的一种途径。虽然通过体外实验，我们发现对气道平滑肌细胞的促生长作用没有受到肛浓度的影响。但是，这一在哮喘中释放增加的细胞因子的确能够引起气道平滑肌细胞的增殖加速。在体内实验中我们也观察到接受浓度暴露致敏大鼠肺部组织中也含量较没有染毒的致敏组有显著升高。也就是说虽然没有直接提高气道平滑肌细胞对的敏感性，但是可能刺激其他细胞释放更多的，进而影响气道平滑肌细胞生长。几不是唯一可以引发平滑肌细胞生长加速的细胞因子，也可能通过其他的细胞因子和生长因子起作用，或者是影响多种因子的共同效应，这还有待进一步实验的探索。另外体外实验还观察到对气道平滑肌细胞表现出一定毒性，而且气道平滑肌细胞对毒性比常用细胞系（如细胞）更为敏感。当被吸入肺部时，直接与接触的肺部细胞（如上皮细胞）很可能也会受到毒性作用产生损伤。而上皮细胞损伤则可以引发一系列炎症反应，炎症细胞的增加和其他免疫细胞的亢奋则可能提高身体对过敏原的反应，从而引发获得性过敏体质。关键词：邻苯二甲酸二乙基己酯，大鼠哮喘模型，气道平滑肌细胞，白细胞介素，（一（），（）（），几一一硕士学位论文，一，几，几一（），：；一硕士学位论文主要英文缩写词英文缩写英文全称中文全称（一）邻苯二甲酸二乙基己酯。溯鸡卵白蛋白乙酰甲胆碱气道高反应呼气气道阻力吸气气道阻力动态肺顺应性气道平滑肌细胞牛血清白蛋白缔冗职业相关哮喘硕士学位论文华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。作者签名：袼孽砰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。作者始关獬导师张哆咿允许北京万方数据电子出版社出版的中国学位论文全文数据库将本人论文以电子、网络、镜像及其他数字媒体形式公开出版。作者签名：关蔺魄卒！本人已经认真阅读“高校学位论文全文数据库发布章程，同意将本人的学位论文提交“高校学位论文全文数据库中全文发布，并可按“章程中的规定享受相关权益。回童途塞堡童厦澄卮！鲣生；旦生；旦三生筮查！作者签名：关黼日期：沙口举善月矽日翮貔碜蚴叩砒日期：移勿笮月日硕士学位论文前言文献综述哮喘是一种气道慢性炎症疾病，会导致支气管阻塞或挛缩，甚至可能因呼吸困难而危及生命。是一种严重影响劳动能力和生活质量的疾病，并且在儿童和青少年中更容易发生。美国称全美有多万哮喘患者，包括万年龄岁以下的小患者。每年，因哮喘恶化而死亡的患者人数在人。我国哮喘患病人数在万以上，其中半数是岁以内儿童。这一数字还在逐年上升，哮喘已成为仅次于癌症的世界第二大致死和致残疾病。典型的哮喘气道慢性炎症反应以和嗜酸性细胞数量增多以及肥大细胞活化为特征，。除了气道内的炎症细胞出现外，哮喘病人气道出现多层次的结构变化被称为气道重塑。典型的气道重塑包括上皮黏液细胞变形，平滑肌细胞肥大和纤维化。哮喘的发生由复杂的遗传和环境因素造成。目前还缺少诊断和判断哮喘程度的唯一指标。所以无论是临床还是实验室研究中都需要综合考虑多个生物学标志。这些标志主要包括组织学特征，炎症细胞，细胞因子和化学因子以及基因表达。口总结了过敏性炎症中细胞因子相互作用和调节关系网络图（图），哮喘作为一种气道慢性炎症，也涉及到这些细胞因子和细胞的作用，这里就实验中常用的尤其是近年来发现的哮喘生物学标志做一些介绍。分子水平标志：蛋白质和基因表达和细胞因子蛋白质是现在生物学研究的热点，在哮喘研究中处于核心地位的蛋白质主要包括免疫球蛋白和数量众多的细胞因子。也一，几，和是哮喘发生中最重要的细胞因子嘟。一和在独特型产生中起作用。又于一起作用于肥大细胞和黏液过量产生以及气道高反应性。几是在嗜酸粒细胞聚集中最重要的细胞因子。下面就对这些主要的和其他一些相对次要的细胞因子做单独介绍。在哮喘中的作用已经被详细的研究。抗原特异性与其相应的受体结合引起一系列细胞事件，包括树突细胞进行抗原递呈和肥大细胞脱颗粒，释放的多种因子综合产生了哮喘症状。小鼠中的实验表明降低水平能有效减轻过敏性硕士学位论文炎症反应。也就成为新一代治疗药物的目标分子【引。肥大细胞的活化引起气道中嗜酸粒细胞和细胞的聚集引。而细胞产生多种炎症因子，如，。被认为是炎症反应的核心细胞。：在过敏性炎症包括哮喘中一个重要生物活性是其可以引导细胞分化为细胞。而类细胞分泌的几一和都在炎症反应中扮演重要角色，这点我们会在后面对其他细胞因子的介绍中看到。一般认为厂的作用主要在于炎症的开始阶段，而在炎症效应阶段不是关键性的，但也有研究指出，在效应阶段仍在增进细胞聚集中起重要作用【。临床实验显示通过可溶性受体抑制的治疗可以在严重哮喘患者身上看到效果【】。：几开始被认为是一种由细胞分泌的，可促使活性细胞终分化为免疫球蛋白生产细胞引。现在认识到几是嗜酸粒细胞成熟和分化的主要因子呻。对嗜酸性细胞的最终分化，迁移和寿命延长起决定作用。实验表明抗治疗可以大量减少气道嗜酸性细胞和表达的嗜酸性细胞以及肺罐洗液中的口町。在抗原刺激前几小时或者天后使用抗单克隆抗体都能减少气道中的嗜酸粒细胞。对于或者链缺乏的小鼠进行抗原致敏和刺激发现缺少气道高反应性和肺中嗜酸粒细胞引。进一步说明了在过敏性炎症中的重要性。使用抗单克隆抗体治疗小鼠可几乎完全抑制由抗体吸入引起的表皮下和支气管周的纤维化。同时抗单克隆抗体治疗也能使哮喘病人的气道重塑得到改善嘲。关于和嗜酸粒细胞介导的气道重塑的机制还有待进一步的研究来揭示。已进行的研究显示对也的抑制可以显著减轻气道炎症和气道敏感性啪。更近些的研究说明一在气道重塑的一些方面也起作用。越来越多的证据显示通过作用于嗜酸粒细胞和平滑肌细胞在过敏反应中起关键作用。并且这一过程和经典的嗜酸粒细胞和介导的过程不同口。在鼠类哮喘模型中发现用可溶性（可与结合但不与结合）中和内源性。可以大幅减低抗原暴露下的哮喘症状陇。在几缺乏的小鼠中虽然抗原刺激可以引起几和气道炎症的产生，但是并不能引起气道高反应性和黏液产生啪。作为哮喘中一个效应分子的更直接证据是在小鼠体内只要激活就足以引起多种哮喘中的特征症状，如嗜酸粒细胞炎症，黏液过量产生，气道高反应性。在肺部特异性的表达就能引起哮喘典型症状的产生汹。这些结果都说明独立于其他类细胞因子，在哮喘的效应阶段的主要过敏性炎症反应中既是必须的又是充分的。硕士学位论文图过敏性炎症中细胞因子相互作用和调节关系网络图：也是由细胞分泌的一种在哮喘病理过程中起作用的细胞因子汹。基因分析显示了与气道高反应性之间可能的相关性。在哮喘患者的支气管组织中的表达也有上升啪。使用中和的抗体实验进一步证明了一在哮喘过敏反应中扮演重要角色啪。研究表明在黏液产生和肥大细胞在黏膜的聚集过程中起关键作用。一可能是通过介导的通路引起黏液产生的。虽然对杯状细胞和肥大细胞起作用，但是通过一缺乏的小鼠实验证明对细胞和免疫球蛋白应答起极少或不起作用啪，。：是类细胞的主要细胞因子，在决定过敏性炎症的发展中起重要作用。可抑制抗原诱导产生的气道嗜酸粒细胞和气道高反应性心。在受硕士学位论文体缺乏的小鼠中，吸入抗体将引起更长时间的气道嗜酸粒细胞浸润脚。总的来说可以反向平衡介导的气道过敏性炎症和类细胞分泌的引起的过量表达【】。一（）例成为了哮喘研究中的重要指标。也就是我们常说的细胞平衡。另一方面，也有研究显示与细胞共存时，反而加重了介导的过敏反应【。由于本身可以抑制细胞活性汹和气道过敏性炎症。推测细胞对细胞介导的炎症加强作用是由于细胞产生的。也就是说活性细胞在调节气道过敏性炎症中扮演什么样的角色，主要是由其分泌的，比例来决定的。也：是由抗原递呈细胞（如树突细胞和巨噬细胞）产生的。在接触抗原的最初阶段对细胞的分化起重要作用。哮喘病人的肺泡灌洗液样品中表达下降。鼠类哮喘模型也证明在免疫的最初的阶段添加外源的可以抑制由抗原刺激引起的细胞产生，从而抑制后续的炎症反应姗。完全分化的细胞失去对的应答，并且不太可能再转化为细胞，但是仅仅在抗原再次接触时添加仍能起到抑制炎症作用。这可能是由于也增加了细胞，细胞和自然杀伤细胞的产量，从而抑制了细胞介导的过敏性炎症。最早被称为释放因子四。在，缺乏的小鼠中抗原引起的气道嗜酸粒细胞浸润更严重嘲。在促进吖产生和抑制依赖于几的产生中和几起协同作用。所以总的来说，几在过敏性炎症中起负调控作用。：也是由树突细胞和巨噬细胞产生的，是一种和相关的细胞因子。在（受体的组成成分）缺乏的小鼠实验中发现细胞，气道中嗜酸粒细胞和杯状细胞数量的显著上升。证明对细胞的免疫应答也起负调控作用。家族：几家族最早的成员是年发现的。随后又有种细胞因子，（被称做几），加入这个家族。和主要由最近发现的一个细胞亚群表达，这一类细胞也被命名为细胞，并且几家族被认为与自身免疫疾病有关。在哮喘病人的气道中也有几的表达。几是由细胞和肥大细胞产生的。虽然在肺中对几的单独过量表达不能引起气道过敏性炎症。但是可显著提高由抗原引起的气道中嗜酸粒细胞和细胞聚集钉。：在哮喘病理过程中表现出促进炎症的活性，主要包括促进白细胞聚集和促进细胞因子和化学因子的产生，。哮喘病人的肺泡灌洗液样本中可检测到水平上升。硕士学位论丈神经生长因子（）：目前受到极大关注的一类细胞因子。年首次报道了在过敏性炎症中水平的升高汹。一年后哮喘病人血清中水平升高也被报道叫。是由与哮喘有关的炎症细胞生产和释放的。年最早报道了鼠类肥大细胞可以合成，储存和释放。最近研究显示人类肥大细胞不仅可以合成，而且可以在活化后释放。受体在过敏炎症细胞（肥大细胞，嗜酸粒细胞，白细胞）上都有表达。基因表达分子生物学技术是现代生物学研究的重要工具。哮喘研究中也经常用到检验和使用转基因实验动物等技术，例如上述细胞因子的研究成果中（的检测引，过量表达的转基因技术射。尤其是建立在对小鼠基因组的广泛了解上，目前用于哮喘研究的数十种细胞表面受体基因，细胞因子相关基因和化学因子相关基因的变异品种都已建立。以细胞因子相关基因敲除为例就有：，受体，几一，粥，吖，盯受体矧。使用也缺乏的老鼠研究清楚的表明在过敏性炎症反应是必须。因为与野生型相比抗原引起的过敏性炎症在儿缺乏的小鼠中显著的下降畸。哮喘病人支气管组织中的表达于健康的志愿者相比升高了哑。通过转基因方法过量表达几则可以引起嗜酸粒细胞浸润晦引。最近缺少的小鼠被用于研究和嗜酸粒细胞在气道重塑中的作用瞰。在哮喘中的重要作用也通过基因的多态性与哮喘之间的密切相关性得到了支持嘶。通过转基因方法在肺部特异性过量表达引起气道高反应性和形态学变化与哮喘症状极为相似嘲。这种例子不胜枚举，由于细胞因子之间的网络作用错综复杂，使用分子生物学方法对单一细胞因子的作用进行研究不仅是非常普遍也是非常有效和有说服力的。细胞水平标志：炎症细胞和组织细胞从上面的介绍不难看出，细胞因子都是由不同细胞产生的，而这些细胞因子最终也是通过作用于特定细胞起作用，所以了解哮喘的病理机制，就离不开这些细胞。与哮喘有关的细胞主要有：嗜酸粒细胞，树突细胞，巨噬细胞，自然杀伤细胞，肥大细胞，几细胞，上皮细胞，血管内壁细胞，皮肤角化细胞等。下面对其中一些细胞做单独介绍。硕士学位论文肥大细胞：是哮喘早期最重要的细胞畸引。肥大细胞通过被抗原活化后能分泌种类广泛的介质在哮喘病理过程中起作用。再次暴露在之前接触过抗原中，抗原会和与肥大细胞受体连接的抗体结合。这一过程引起肥大细胞合成前炎症因子嘲。肥大细胞释放的介质可以分为预先合成的介质（如组胺），新合成的脂类介质，细胞因子和生长因子（如仅和）嘲。肥大细胞释放的组胺被认为是引起支气管狭窄和痉挛的原因。同时肥大细胞还可以产生，储存以及释放神经生长因子。嗜碱粒细胞：除了肥大细胞以外，另一类表达的细胞。并且在再次接触抗原时脱颗粒。类化学因子（如，），组胺释放因子等呻都可以引起嗜碱粒细胞介质的释放。嗜酸粒细胞：嗜酸粒细胞是气道炎症进行过程中也就是哮喘晚期的核心作用细胞。可以被多种因子激活，如类化学因子，血小板活化因子（），导致释放炎症介质，如主要基质蛋白（），嗜酸粒细胞阳性蛋白（）嗽。这些因子的作用造成气道内皮细胞，细胞外基质和神经原损伤。并引起细胞和更多嗜酸粒细胞在气道的聚集引。在临床上广泛用作嗜酸粒细胞活性的标志分子。的活性机制是其具有细胞毒性，可以在细胞上造成穿孔。这种毒性对于细菌，病毒，寄生虫和呼吸道上皮细胞都有作用。体外实验表明还可以促进黏液产生以及肥大细胞和嗜碱粒细胞释放组胺嘲。嗜酸粒细胞释放多种细胞因子包括几，几，也，几，仅，口。这些因子可以通过自反馈作用进一步促进嗜酸粒细胞聚集。嗜酸粒细胞可能是通过口和引起黏液造成气道重塑的旧。嗜中性粒细胞：嗜中性粒细胞在哮喘晚期也扮演重要角色，它可以产生种类繁多的产物，包括脂类，细胞因子，蛋白酶，活性氧和。这些产物可以引起气道狭窄增加黏液分泌汹。蛋白酶中的胰肽酶可以引起上皮细胞过量分泌黏液和降低纤毛摆动频率。并且引起上皮细胞释放可能还有其他细胞因子。胰肽酶通过增加通透性和促进细胞凋亡损伤内皮细胞并且活化肥大细胞和嗜酸粒细胞旧。细胞：细胞被认为是哮喘病理反应的主要效应细胞，但是近年来更多的细胞亚型被认识，丰富了我们对于哮喘免疫调节的视野。年细胞是哮喘的必要的因子被首先报道。人体内存在着和细胞的相互负调节作用，虽然细胞被认为是哮喘的主要效应细胞，但是最新的研究表明，细胞在完整的过敏反映中起协同作用，我们称为平衡。调节细胞是现在研究前沿关注的一类细胞，以大量表达受体（）为特征，对介导的哮喘有负硕士学位论文调节作用。自从年发现中度到重度的哮喘病人的肺部细胞为自然杀伤细胞以来，自然杀伤细胞也受到高度重视。关于细胞在哮喘中作用的研究，大量是通过鼠类的哮喘模型开展的，动物实验极大的丰富了我们对细胞的认识，但是我们不能忘记这些模型并不完美的，简单的说，鼠类和人类的免疫系统有许多的不同晦。对于哮喘而言一些人类哮喘是不能在鼠类的诱发的，另一些则是通过不同机制产生。巨噬细胞：巨噬细胞在炎症反应中扮演双重角色，一方面巨噬细胞在抗原刺激后在炎症部位聚集旧。分泌出多种细胞因子和化学因子包括几，吖，师仅，【广，盯，引起其他炎症细胞的聚集和活化。另一方面巨噬细胞又是重要的免疫调控细胞可以使一些处于可逆状态的细胞对抗原暴露不应答，从而影响整个炎症应答过程口引。内皮细胞：内皮细胞可以分泌属于免疫球蛋白超家族的一些黏附蛋白，如舢订，。这些因子帮助炎症细胞运动到炎症部位聚集起来。气道平滑肌细胞：人类气道平滑肌细胞在哮喘中对气道高反应性和气道阻塞起作用。体外实验发现在细胞因子的刺激下（如，几口，和）气道平滑肌细胞能分泌一些化学因子如，和。上皮细胞：支气管上皮细胞在过敏性炎症中是一种活性细胞，可以分泌前炎症介质。在抗原刺激的哮喘症中，和在气道上皮细胞中显著上升，在肺泡灌洗液中含量也有所上升。当嗜酸粒细胞大量表达（的受体）时，上皮细胞表达，在哮喘症状中这两种分子表达水平都升高口。组织水平标志：气道重塑虽然细胞和分子水平上的检测更精确和便于分析，但是组织学特征作为哮喘研究中一个历史悠久的病理特征，以其直观性和整体性在今天研究中仍有一席之地。其实组织学上的病变就是这个复杂疾病的综合表现，我们研究哮喘的最终目的也就是解决这些病变给病人带来的痛苦。气道炎症，呼吸阻力和支气管肥大是哮喘的典型表型特征，这些特征统称为气道重塑，但是气道重塑除了指这些结构上的变化以外也包括肺功能的改变。临床上，哮喘中的呼吸阻力经常不是完全可逆的，哮喘病人面临一个逐渐的和加速的肺功能硕士学位论文丧失过程。例如支气管肥大说明气道平滑肌和与其相关的气管壁结构的变化。通过实验动物和死于哮喘的病人的尸体的组织病理学检查可以清楚的看到气道形态和结构上相对于没有哮喘个体发生的变化。气道重塑是引起哮喘典型症状气道高反应性一个重要原因，在上面章节讨论过的多种细胞中气道平滑肌细胞（，）的体量增加在整个重塑反应中扮演着关键角色，因此也有可能成为治疗慢性哮喘的新靶标细胞口钉。气道平滑肌细胞体量增加是由气道平滑肌细胞肥大和过度增生引起的口引，其中过度增生作用被更广泛的研究。如图所示，口总结了过敏性或者非过敏性刺激可以引起气道平滑肌细胞肥大和过度增生从而导致气道壁增厚和气道高反应性。能够对这种过度生长机制以及药物对其调节作用进行研究的体内模型相对较少。人工饲养的气道平滑肌细胞成为体外研究这种机制的选择。长期的气道炎症反应对气道重塑过程有多方面的作用，发现的各种化学介质数量还在随着研究的进展不断增加，目前还不知道气道重塑是具体哪种化学介质的作用。气道中的炎症和结构细胞释放的细胞因子，化学因子和生长因子被认为都在气道重塑中扮演了重要的角色啦，这些因子已经在上面的章节中做了详细的讨论。硕士学位论文困图过敏性或者非过敏性刺激通过气道平滑肌细胞肥大和过度增生引起气道壁增厚和气道高反应性硕士学位论文实验材料二材料与方法实验动物大鼠哮喘模型使用级大鼠共只，雄性，购自湖北省实验动物中心。实验过程中除处死前一天外实验动物都允许自由进食饮水，保持饲养环境清洁。每天染毒前称量体重。气道平滑肌细胞原代细胞同样取自级大鼠，雄性，购自湖北省实验动物中心。动物饲养在清洁环境中，允许自由进食饮水，处死前称量体重。主要试剂邻苯二甲酸，基己酯（，一（），），鸡卵自蛋白（，戊巴比妥钠（，），乙酰甲胆碱（，），大鼠试剂盒（公司），噻唑蓝（，北京普博欣生物科技有限责任公司），大鼠（，），高糖培养基（公司），新生牛血清（公司），牛血清白蛋白（），胰酶（），小鼠抗平滑肌特异性肌动蛋白单克隆抗体（，武汉博士德生物工程有限公司），一羊抗小鼠（武汉博士德生物工程有限公司）主要溶液大鼠哮喘模型使用的溶液：（）生理盐水（）（）致敏用溶液：和（）溶于生理盐水中用针管混匀，使用前现配（）雾化用溶液：溶于生理盐水中磁力搅拌器混匀，使用前现配（）肺部滴注染毒使用的：将和吐温按：体积比混合均匀，溶于生理盐水中硕士学位论丈气道平滑肌实验使用的溶液：（）细胞实验染毒液使用的：将和吐温按：体积比混合均匀，溶于含有血清的高糖培养基中（）：，加超纯水至，高压灭菌（）：，抽滤灭菌，分装后于一。保存（）高糖培养基：每包溶解于高压灭菌后的超纯水中，磁力搅拌器混匀，定容至，加调节至。抽滤灭菌，做菌检，分装后于。保存（）碳酸盐缓冲液：，溶液：（溶于超纯水中）溶液：（溶于超纯水中）取溶液与溶液混合（）缓冲甘油：份甘油和份碳酸盐缓冲液混合（）透化用：（）封闭非特异性抗原用：染色相关溶液（）组织固定液（氏液）：苦味酸饱和水溶液甲醛冰醋酸（）福尔马林液：份甲醛液份蒸馏水市场上出售的甲醛液约含的甲醛，福尔马林液实际上仅含的甲醛。（）氨酒溶液：氨水乙醇（）醋酸酒溶液：醋酸酒精（）埃立氏苏木精染液（）曙红硕士肇位论文主要仪器（）动物肺功能分析系统（北京贝兰博科技有限公司）系统采用传统的体积描记法可以测量和计算呼气气道阻力（，），吸气气道阻力（，），动态肺顺应性（，）等生理数据。如图所示，该套设备由计算机，动物呼吸机，信号调理器和体描箱组成，可以通过专用软件，对实验数据进行实时监测和记录，并进行数据的统计分析。图动物肺功能分析系统结构示意图（）酶标仪（）用于和检测（）荧光显微镜（）普通光下可进行细胞计数，荧光下观察免疫荧光鉴定原代培养的气道平滑肌细胞（）倒置显微镜（重庆光学仪器厂）用于日常观察细胞瓶内和孔板内细胞生长情况（）其他仪器：雾化器，冷冻离心机，切片机，生物安全柜，细胞培养箱，冰箱，烘箱，真空抽滤泵，灭菌锅等硕士学位论文实验方法大鼠哮喘模型的制备和暴露肺部滴注法染毒染毒组的大鼠每天一次进行肺部滴注，每次每只滴注液体量为，依据分组不同滴注液中含量相当于在空气中浓度为或者的环境下工作小时吸入的量。无染毒组则使用相同方法注射等量生理盐水进行对照。（）将大鼠用乙醚麻醉，待其全身松弛无反抗动作后移到专用支架上（）用大镊子打开口腔，拉出舌头，通过胸部灯光透射，气管清晰可见（）用特制肺部滴注针头小心插入气管中，注射染毒液致敏需要致敏各组的大鼠在第天和第天进行腹部皮下多点注射致敏液，致敏液按照主要溶液中致敏用溶液方法配置，每次每只大鼠注射总量为。在第至天进行雾化吸入，雾化液按主要溶液中雾化用溶液方法配置，每天每只大鼠雾化。超声波雾化器流量设置在中档，以使实验动物能有效吸入雾化气体，气雾又不致影响体征观测为度。哮喘模型制备流程如图所示，实验中只大鼠随机平均分配为组，每组只组生理盐水对照组：使用生理盐水进行肺部滴注，腹腔皮下注射致敏和雾化组染毒组：使用相当于暴露量进行肺部滴注，使用生理盐水进行腹腔皮下注射致敏和雾化组染毒组：使用相当于暴露量进行肺部滴注，使用生理盐水进行腹腔皮下注射致敏和雾化组致敏组：使用生理盐水进行肺部滴注，使用溶液进行腹腔皮下注射致敏和雾化组染毒致敏组：使用相当于暴露量进行肺部滴注，使用溶液进行腹腔皮下注射致敏和雾化组染毒致敏组：使用相当于暴露量进行肺部滴注，使用溶液进行腹腔皮下注射致敏和雾化所有组大鼠在第天进行肺功能检测硕士学住论文厂一一。咖厂上厂一吲。娜厂久厂一鲥上、厂一“一厂上搿溺厂一。哪厂努蛸图大鼠哮喘模型的制备和暴露流程图（生理盐水对照组；染毒组；染毒组；致敏组；染毒致敏组；粕致敏组；：肺功能检测）肺功能检测各实验组在最后一次激发后分别进行肺功能检测。（）仪器设置呼吸频率设为次，呼吸比设为：。（）实验动物麻醉大鼠称重后，按每体重戊巴比妥钠的用量腹腔注射质量分数为的戊巴比妥钠溶液。气管插管待实验动物完全麻醉后，用酒精棉球对颈部皮肤消毒，剪开颈部皮肤暴露出气管，在气管上剪开一小口，开口长度约为气管周长的，插入气管插管，用棉线固定后迅速移入体描箱中，将插管与动物呼吸机相连。颈外静脉插管继续向一侧剪开颈部皮肤，暴露出颈外静脉，小心将输液针头插入颈外静脉中并固定，关闭体描箱。（）注射乙酰甲胆碱打开肺功能数据记录和分析软件（如图所示），待各项参数稳定后开始通过颈外静脉插管注射乙酰甲胆碱，每只大鼠注射次，乙酰甲胆碱注射剂量按注射顺序依次为每体重，两次注射之间间隔分钟。整个过程中使用软件实时记录呼气气道阻力（），吸气气道阻力（）以及动态肺顺应性（）的变化。笆兰墼些望垫兰三三兰兰三三兰三三三孑匠主薹幽丛霹睦筹筹带瓮瓮瓮瓮铃等等令铃锩孓摩季蚕霍三三三；三二；巨：丰。：之！一硕士学位论文肺组织切片染色（）肺组织的分离及固定：肺功能实验结束后完全剪开大鼠胸腔，从气管插管上方剪断气管，小心提起气管，剪断附着的食道和结缔组织后可完整取出肺组织和心脏。将气管插管连接到注射器，慢慢向肺中压入气体使肺叶充分膨胀，用棉线在所需肺叶主支气管处结扎，剪下所需肺叶，用擦镜纸小心吸去表面血液，剪掉多余脂肪和结缔组织后将肺叶泡入组织固定液（氏液）中。（）肺部抽气：在固定至之后，将泡在固定液中的肺组织取出，切成边长厘米的小块，置于真空抽气装置中。打开真空抽气阀门，放置大约分钟，可见肺组织中的空气被排出，以肺组织下沉为标准。（）继续在固定液中固定。（）浸在酒精中，洗三次，每次不少于。（）浸入氨酒中，反复浸洗几次，直至黄色完全洗去为止。（）进入酒精中反复浸洗数遍。（）浸入醋酸酒媒染。（）浸入蒸馏水洗三遍，每次，后用自来水碱化。（）依次经蒸馏水，酒精，然后经曙红，纯酒曙红（每次小时）逐级脱水。（）依次经香柏油，纯香柏油使之透明。（）进蜡一次，时，然后进纯石蜡三次，每次，时，然后封蜡。（）依次切片，展片，脱蜡，盖片，烘烤天后即可。肺部匀浆的一检测实验动物完成肺功能测定后，除固定用于组织切片的肺叶外，另取一片肺叶冷冻保存备用。使用公司的大鼠几试剂盒，按照试剂盒说明书进行大鼠几标准曲线制作和实验大鼠肺组织匀浆中含量测定。大鼠气道平滑肌原代细胞提取（）脱颈处死雄性大鼠，全身浸泡在酒精中约分钟，移入生物安全柜中，用棉球擦干体表，剪开颈部皮肤，取出气管浸泡在高压灭菌过的并加有双抗的中，洗去血液，并用刀片和剪刀小心去除粘连的结缔组织。（）处理干净的气管，剪碎成小块，于胰酶中消化分钟。硕士学位论文（）取洁净无菌的细胞培养瓶，加入含有血清培养基少许，以细胞瓶平放时能刚好覆盖底面薄薄一层为度，稍微震荡使液体分布均匀后倒掉培养基，将细胞瓶水平在酒精灯火焰上晃动，烤干残留在瓶中的培养基，自然冷却备用。（）心倒掉胰酶溶液，向气管碎块中加入少量培养基终止消化，然后挑选大小适中的碎块，沾附于培养基处理过的细胞瓶底面，每瓶放块，均匀分布。（）将瓶倒置，每瓶加入含有血清和双抗的培养基，不使组织块和培养基接触，盖上瓶盖，移入细胞培养箱中，保持倒置。（）后小心翻动细胞瓶，使组织块浸泡在培养基中，但仍然紧贴瓶底，不浮起。（）天后添加含有血清和双抗的