抗菌肽基因Gnk21经花粉管通道法导入西瓜的初步研究

园 艺 学 报 2014，41（7）：14671475 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140420；修回日期：20140603 基金项目：国家自然科学基金项目（31372086） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangxian098） 抗菌肽基因Gnk2-1经花粉管通道法导入西瓜的初步研究 许珺然，张 显*，张 勇，马建祥 （西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100） 摘 要：通过花粉管通道介导银杏抗菌肽基因Gnk2-1于西瓜自交系04-1-2中，以浓度为100、200、300和400 ng L-1的DNA为供体，分别于授粉后24、27、30和33 h导入，对子代进行PCR检测。结果表明：T0代坐果率和单瓜结籽数随授粉后处理时间的增加而升高，但在各个处理时间下均显著低于对照；外源DNA的导入对授粉后27 h处理的T1代种子发芽率和授粉后24 h处理的T1代种子出苗率均造成显著降低；不同DNA浓度转化的T1代种子的发芽率和出苗率与对照相比差异不显著；对1 280株T1幼苗进行PCR检测，得到32株阳性转化植株，总体转化率为2.5%，最佳转化时间为授粉后24 27 h，最佳DNA转化浓度为100 200 ng L-1；PCR阳性植株抗病鉴定表明转基因植株对西瓜枯萎病的抗性有所增强。 关键词：西瓜；花粉管通道法；分子检测；抗菌肽 中图分类号：S 651 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1467-09 Introduction of Antimicrobial Peptide Gene Gnk2-1 into Watermelon via Pollen-tube Pathway XU Jun-ran，ZHANG Xian*，ZHANG Yong，and MA Jian-xiang （College of Horticulture，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China） Abstract：In order to study the feasibility of transferring exogenous DNA into watermelon by pollen-tube pathway，the antimicrobial peptide gene Gnk2-1 was introduced into watermelon accession 04-1-2by pollen-tube pathway with different concentration（100，200，300 and 400 ng L-1）at different time（24 h，27 h，30 h，33 h）after self-pollination. Seeds from treated fruits were harvested and tested by PCR. The results were as follows：The fruit setting rate and average number of seeds of T0 generation increased with the increment of treatment time after self-pollination，though the two figures both showed a significant decrease under all treatments compared with control. The germination rate of T1 seeds treated 27 h after self-pollination and the seedling emergence rate of T1 seeds treated 24 h after self-pollination decreased significantly. Compared with control，there was no distinct difference illustrated in the rate of germination and seedling emergence of T1 seeds between different concentration treatments. The PCR results of 1 280 tested T1 seedlings showed 32 positive plants and the total transformation rate was 2.5%. The optimum transformation time was 2427 h after self-pollination and the optimum transformation 1468 园 艺 学 报 41卷 concentration were 100200 ng L-1. The positive plants were inoculated with Fusarium and showed a stronger resistance compared with non transgenic plants. Key words：watermelon；pollen-tube pathway；molecular detection；antimicrobial peptide 西瓜（Citrullus lanatus）生产过程中常受到各种病害的威胁，尤以枯萎病最为严重（宋荣浩 等，2009）。由于近几十年来中国在西瓜育种的过程中所采用的亲本资源雷同和重复，造成品种的遗传基础变化趋向狭窄，利用常规育种转育抗性的品种周期长、难度大（高宁宁 等，2011），因此通过遗传转化手段来增强西瓜抗性，改善果实品质具有重要意义。 抗菌肽是指具有抗菌作用的一些氨基酸数小于100的小分子肽。其广泛存在于植物、细菌、脊椎动物及无脊椎动物体内（Hancock，2001），对多种植物和动物病原菌具有广谱抗性，且水溶性好，热稳定，不易产生耐药性（翟朝阳，1996）。从银杏种仁中提取出来的抗菌肽蛋白Gnk2-1已被证实对瓜类尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、炭疽菌（Colletotrichum orbiculare）等瓜类病害真菌有较强的抑制作用（牛卫宁和郭蔼光，2003；荆贝贝 等，2006；Yoriko et al.，2007；刘缙 等，2012），在转基因抗病育种研究中极具应用前景。 花粉管通道法又称授粉后外源基因导入植物技术，其利用授粉后所形成的天然花粉管通道经珠心将外源DNA或者特定基因携带进入胚囊，导入受精卵，以达到遗传转化的目的。该方法由周光宇等（1983）首次提出（Zhou et al.，1983），自黄俊麒等（1981）首次利用该方法成功培育出抗枯萎病棉花新品种后，在水稻（Luo & Wu，1989）、大豆（Shou et al.，2002；Yang et al.，2011）、烟草（崔红 等，2003）、小麦（令利军 等，2004）、玉米（曹士亮 等，2013）等重要农作物的育种方面成功应用。目前西瓜遗传转化研究主要是依靠农杆菌介导法获得转基因植株，此法对组织培养技术、操作技能及试验条件要求严格，且因西瓜高效转化体系的不成熟常导致转化效率降低。花粉管通道技术具有简单易行（赵世锋 等，2003）、基因源广（刘宝龙和张怀刚，2004）、可直接应用于常规育种（李玲玲 等，2007）等优点。本研究中试图利用花粉管通道法将抗菌肽基因Gnk2-1转入西瓜植株中，以开辟西瓜转基因育种和种质创新新途径，为进一步获得抗病西瓜新品种奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 受体西瓜稳定自交系为04-1-2，西瓜枯萎病菌为2号小种，由西北农林科技大学园艺学院西瓜课题组提供。根癌农杆菌GV3101，内含双元表达载体pARSGnK2-1，该载体上含有银杏抗菌蛋白基因Gnk2-1。质粒为pKANNIBAL和pART27。菌株和质粒均由西北农林科技大学郭蔼光教授惠赠，载体结构见图1。 图1 表达载体pARSGnK2-1结构简图 Fig. 1 Construction of expression vector pARSGnK2-1 1.2 试验方法 1.2.1 质粒DNA的提取及导入液制备 2013年5月采用常规碱裂解法（萨姆布鲁克和拉塞尔，2008）提取质粒DNA，用适量TE溶液7期 许珺然等：抗菌肽基因Gnk2-1经花粉管通道法导入西瓜的初步研究 1469 （pH 8.0）溶解，经紫外分光光度计检测其OD260/OD280的比值均在1.7 1.9之间，经琼脂糖凝胶电泳观察其分子量均达50 kb以上，表明所得质粒DNA纯度和分子量符合转化要求。用TE（pH 8.0）缓冲液将质粒DNA溶液稀释为4个浓度：100、200、300和400 ng L-1，保存于20 冰箱中。 1.2.2 植物材料的种植与转化 2013年5月将西瓜幼苗定植于西北农林科技大学园艺试验场大棚，按常规方法进行整枝和田间管理。在2013年6月盛花期对隔天将要开放且子房发育正常的雌花于下午进行套袋隔离，开花当天89时对雌花人工进行自交授粉，分别在相应的花序上挂标签标记授粉时间。根据预试验结果确定分别于授粉后24、27、30和33 h，用微量注射器吸取8 10 L不同浓度导入液进行子房注射。注射器针头应与子房垂直，以扎入子房中轴位置为准。导入的当代记为T0。 2013年7月按不同处理收获果实，收集种子，统计各处理的导入花朵数、坐果数和单瓜结籽数，收获的种子记为T1。每个处理随机挑选100粒饱满的种子进行常规催芽并播种于灭菌基质中，分别统计每个导入时间下4个导入液浓度处理的发芽率总和和出苗率总和，以及每个导入液浓度于4个导入时间处理的发芽率总和和出苗率总和。 1.2.3 T1代PCR检测 2013年1011月待T1代西瓜幼苗长出3片真叶时，采用CTAB法提取叶片DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。根据目的基因Gnk2-1设计引物，5和3端引物分别为5-TCATTCTTGCATTC GCATTG-3和5-GGCACCGATAGCGTTGTT-3，扩增片段长度为326 bp。反应体系为20 L，含TaqDNA聚合酶0.3 L，10 Buffer（Mg2+）2 L，25 mmol L-1 MgCl2 1.6 L，2.5 mmol L-1 dNTPs 1.6 L，5和3端引物各1 L，待测DNA 1 L。温度循环条件为94 预变性5 min，94 变性30 s，54 退火30 s，72 延伸30 s，35个循环；72 延伸10 min。以未转化的植株叶片DNA作为阴性对照，以质粒DNA作为阳性对照。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.4 T1代阳性植株的抗病鉴定 2013年11月选取株高和长势一致的T1代PCR阳性植株和非转基因植株幼苗，用清水洗净根部，剪掉主根末端约1 cm，在孢子浓度为5 106 mL-1西瓜枯萎病2号小种孢子悬浮液中浸泡20 min，对照植株于灭菌水中浸泡20 min，取出后重新栽入灭菌基质中。接种一周后观察植株发病情况。 2 结果与分析 2.1 不同处理方法对结实性及种子数的影响 由表1可知，花粉管通道法导入外源DNA对西瓜植株的坐果和果实结籽均有影响，与未导入外源DNA的对照相比，坐果率和单瓜结籽数均有显著降低。不同转化时间相比较，授粉后24 h转化处理的坐果率最低，总共处理了210朵花，共收获果实21个，平均坐果率只有10%，特别是在400 ng L-1导入液处理下，坐果率为0，说明过早处理对花器的伤害较大，影响了果实和种子的发育。随着时间的推移，授粉后27 33 h，坐果率呈逐渐增加的趋势：授粉后27 h转化处理的平均坐果率为35.5%，30 h处理的为42.2%，33 h处理的为59.3%，说明随着花器的发育，子房对处理所造成伤害的耐受能力逐渐增强。 此外，花粉管通道法转化果实内种子数也呈现随处理时间的推迟而增多的趋势，授粉后24 h转化处理的平均单瓜结籽数只有42粒，与对照相比较减少了74.7%；27 h处理的为67粒，减少了59.6%；30 h处理的为125粒，减少了24.7%；33 h处理的为118粒，减少了28.9%。同一处理时间下，不同导入液浓度对西瓜的坐果率和结籽数的影响亦存在显著差异。 1470 园 艺 学 报 41卷 表1 不同转化时间和浓度对西瓜坐果率及结籽数的影响 Table 1 The effect of transformation time and concentration on watermelon fruit setting rate and amount of seeds 导入时间（授粉后时间）/h Transformation time （Time after pollination） 导入液浓度/（ng L-1）Transformation concentration 处理花数 Number of transformed flowers 坐果数 Number of fruit-setting 坐果率/% Fruit setting rate 平均单瓜结籽数 Amount of seeds 100 60 5 8 c 28 d 200 50 10 20 b 58 b 300 50 6 12 c 40 c 24 400 50 0 0 d 0 e 对照Control 0 20 17 85 a 131 a 100 50 18 36 c 113 b 200 30 10 33 cd 44 d 300 35 10 28 d 34 e 27 400 40 17 42 b 75 c 对照Control 0 20 18 90 a 160 a 100 30 10 33 d 116 c 200 30 10 33 d 100 d 300 45 20 44 c 114 c 30 400 30 17 56 b 169 b 对照Control 0 20 19 95 a 183 a 100 40 28 70 b 132 b 200 30 18 60 c 81 d 300 40 15 37 d 138 b 33 400 30 22 73 b 120 c 对照Control 0 20 18 90 a 190 a 注：对照只进行自交授粉，未注射DNA溶液。同列数字后不同小写字母表示同一授粉时间不同处理浓度间在5%水平显著性差异。 Note：Control only self-pollination without transferring DNA solution. Values followed by different letters in a column mean significance among treatments under same transformation time at the 5% level. 2.2 不同处理时间对种子发芽率和出苗率的影响 由图2，A可知，利用花粉管通道法将外源DNA于授粉后不同时间段导入受体，其T1代种子的发芽率和出苗率均低于对照。授粉后27 h转化的种子发芽率最低，为83%，比对照低15%；另3个时间段转化的种子发芽率均大于90%，与对照无显著性差异。授粉后24 h转化的出苗率显著低于 图2 不同转化时间（A）和不同导入液浓度（B）对T1代种子发芽率和出苗率的影响 方柱上不同小写字母表示处理间差异在5%水平显著性差异。 Fig. 2 The effect of transformation time（A）and transformation concentration on germination and seedling emergence rate of T1 seeds Different small letters above the bars denote significant difference at the 5% level between treatments. 7期 许珺然等：抗菌肽基因Gnk2-1经花粉管通道法导入西瓜的初步研究 1471 对照，另3组处理与对照无显著差异；不同转化时间处理的出苗率在80% 90%之间。 2.3 外源DNA浓度对种子发芽率和出苗率的影响 由图2，B可知，利用花粉管通道法将不同浓度外源DNA导入受体，其T1代种子的发芽率和出苗率与对照无显著差异，发芽率均稳定在90%左右，出苗率为82% 89%。 2.4 转基因植株的PCR检测 共检测了T1代1 280株材料，有32株扩增出了326 bp的特异性条带，与阳性对照一致，阴性非转化植株无扩增条带（部分阳性植株电泳结果如图3所示），初步证明Gnk2-1抗菌肽基因已整合到了西瓜基因组中，总体转化率为2.5%。 图3 部分阳性植株PCR检测结果 M：分子量标准（DL1000）；1：阳性对照（Gnk2-1质粒）；2：阴性对照（非转化植株）；3 7：转化植株。 Fig. 3 PCR analysis of some transgenic plants M：DNA marker（DL1000）；1：Positive control（Gnk2-1 plasmid）；2：Negative control（untransformed plant）； 37：Transformed plants. 由表2可知，32株阳性植株来自3种转化时间和转化浓度的组合，其中授粉后27 h以100 ng L-1导入液处理的转化率最高，共检测出17株阳性植株，阳性率为21.3%；授粉后27 h以200 ng L-1导入液处理的转化率次之，共检测出10株阳性植株，阳性率为12.2%；授粉后24 h以100 ng L-1导入液处理的材料检测出5株，阳性率为6.4%。其他处理均未检测出阳性植株。 表2 T1代PCR阳性植株统计结果 Table 2 Result of PCR positive plants 授粉后时间/h Time after pollination 导入液浓度/（ng L-1） Transformation concentration 检测植株数 Number of tested plants PCR阳性植株数 Number of PCR positive plants 阳性率/% Transformation rate 24 100 78 5 6.4 27 100 80 17 21.3 27 200 82 10 12.2 2.5 转基因植株的抗病性鉴定 由图4可见，未接种病原菌的植株生长正常，叶片平展，转基因植株的长势稍弱于非转基因对照植株。接种病原菌的植株均出现了不同程度的萎蔫，非转基因植株子叶枯黄，子叶和真叶均萎蔫下垂，只有一片新叶正常；转基因植株子叶和真叶均平展，仅在子叶边缘和一片真叶叶缘出现枯黄，叶片发病范围小于对照植株，发病迟缓。 1472 园 艺 学 报 41卷 图4 转基因西瓜植株抗枯萎病检测 Fig. 4 Fusarium wilt resistance test of watermelon transgenic plants 3 讨论 花粉管通道技术利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道经珠心将外源DNA携带进入胚囊，转化受精卵或其前后的生殖细胞，由于它们仍处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态，并且正在进行活跃的DNA复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA片段整合到受体基因组中，以达到遗传转化的目的。该技术可用于任何开花植物，不受受体物种、目的基因来源、基因型等因素的限制，无需组织培养、诱导再生等人工培养过程（侯丽霞 等，2007），是一种行之有效的转基因育种方法。目前花粉管通道技术已在棉花（黄骏麒 等，1981，1986；Huang et al.，1999；Zhang et al.，2009）、水稻（Luo & Wu，1989；肖君泽和邓建平，2006）、大豆（雷勃钧 等，2000；Shou et al.，2002；Yang et al.，2011）等作物上得到应用，但在瓜类蔬菜上的应用较少。李涛等（1996）采用花粉管通道法成功将黑籽南瓜DNA导入早花西瓜，并观察到全缘叶性状稳定遗传至D3代；王果萍等（2003）将几丁质酶基因成功导入西瓜并获得抗病植株，且稳定遗传至T3代；哈斯阿古拉等（2007）将gus基因成功导入河套蜜瓜并研究了不同导入时间对转化率的影响；Hao等（2011）将反义ACC氧化酶基因导入甜瓜并得到0.7%的转化率。关于将银杏抗菌肽基因经花粉管通道导入西瓜栽培种进行基因转化的研究目前还未见报道。 本研究中运用花粉管通道技术将银杏抗菌肽基因Gnk2-1导入西瓜，对导入当代进行坐果率和单瓜结籽数的调查，对T1代种子进行出芽率和出苗率的调查，对T1代植株叶片进行PCR检测，对PCR阳性植株进行抗病性鉴定。试验采用子房注射法共处理了640朵花，共收获果实216个，总体坐果率为33.8%，相较于对照90%的坐果率显著降低了56.2%，说明子房注射对花器造成了比较大的伤害，严重影响了果实的发育，极易造成子房死亡或化瓜。随着授粉后转化时间的推迟，坐果率呈上升趋势，由授粉后24 h处理的10%增加到授粉后33 h处理的59.3%，同样说明过早注射对花器的损伤较大，但随时间推移花器趋于成熟，注射器对其的伤害随之减小。西瓜果实的单瓜结籽数随处理时间的推迟亦呈现增加趋势，授粉后24 h处理的平均单瓜结籽数最低，只有42粒，授粉后30 h处7期 许珺然等：抗菌肽基因Gnk2-1经花粉管通道法导入西瓜的初步研究 1473 理的平均单瓜结籽数最高，为125粒，但4个处理时间的平均单瓜结籽数均显著低于对照，说明子房注射对种子的发育也造成了一定影响。 在对T1代种子发芽率的统计中，经过DNA注射处理的种子发芽率均低于对照，授粉后27 h处理的种子发芽率最低（83%），与其他导入时间处理的发芽率及对照均存在显著差异；同一处理时间下不同DNA浓度对发芽率的影响差异不显著，均在90%左右。在对T1代种子出苗率的统计中，经过DNA注射处理的种子出苗率均未大于90%，但随转化时间推迟呈上升趋势；同一处理时间以300 ng L-1导入液处理的出苗率（89%）最高。虽然T1代种子的发芽率和出苗率均低于对照，但总体差异并不大，说明外源基因在导入过程中一定程度上影响了种子细胞内某些平衡，在某种程度上抑制和减缓了细胞的分裂和生长，导致发芽率和出苗率降低，但这种抑制并不显著。 试验共对1 280株T1代幼苗进行分子鉴定，共得到32株阳性植株，总体转化率为2.5%。只有授粉后24 h和27 h处理的植株检测出了阳性条带，授粉后24 h处理的检测出了5株，导入液浓度为100 ng L-1；授粉后27 h处理的检测出了27株，其中17株导入液浓度为100 ng L-1，10株导入液浓度为200 ng L-1。其他转化时间和转化浓度均未检测出阳性植株。可由此得出结论，通过花粉管通道技术对西瓜进行基因转化，最佳转化时间为授粉后24 27 h，最佳DNA转化浓度为100 200 ng L-1。在对T1代PCR阳性植株进行抗病性鉴定可见其较之非转基因植株发病范围小，发病迟缓，可得出结论银杏抗菌肽基因Gnk2-1的转化使受体植株对西瓜枯萎病菌产生了一定抗性。至于抗菌肽基因在后代的遗传稳定性尚不清楚，有待进一步研究。 利用花粉管通道法转化西瓜的转化率不仅受转化时间和DNA浓度的影响，也受基因型、外源基因种类、导入液种类、转化方式和天气状况的影响（侯丽霞 等，2007）。常用的花粉管通道技术操作方法有3种：柱头滴加法、花粉粒携带法、子房注射法。本试验所采用的是子房注射法，该方法转化效率最高，适用于子房较大的受体，但对子房和胚珠造成的损伤亦会增大。后续试验应着重于多因素及不同操作方法对转化效率的影响。 本试验初步证明已利用花粉管通道法将银杏抗菌肽基因Gnk2-1转化入西瓜植株中，转化率为2.5%，高于张志忠等（2005）和孙玉宏等（2007）利用农杆菌介导法导入gus基因分别得到的0.73%和1.5%的转化率。花粉管通道法简单易行，成本低，育种时间短，且西瓜花器较大，易于操作，处理一花可以得到大量种子，故该法适用于西瓜类作物的转化。 References Cao Shi-liang，Wang Cheng-bo，Shi Gui-rong，Qi Yong-hong，Wang Wei，He Qiang，Wang Ming-quan，Lin Zhong-ping. 2013. 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