外植体的选择消毒和接种

第四章 外植体的选择、消毒和接种目的要求掌握选择外植体的方法；熟练掌握接种方法。第一节 外植体的选择 外植体的来源是决定植物组织培养成败的一个重要因素。根据植物细胞全能性的的理论，任何细胞、组织和器官都可以作为外植体，但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大区别。第一，选择优良的种质； 无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。第二，选择健壮的植株； 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。所致。第三，选择合适的部位； 植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功，植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功，这些部位包括：茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表这些部位包括：茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。珠和花药等。 但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难脱分化，或者在分化频率很低。脱分化，或者在分化频率很低。第四，取材季节合理； 对于大多数植物而言，应在其生长的季节开始采对于大多数植物而言，应在其生长的季节开始采样。在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能样。在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。第五，考虑器官的生理状态和发育年龄； 一般认为，沿着植物的主轴，越一般认为，沿着植物的主轴，越向上的部分所形成的器官的生长时间向上的部分所形成的器官的生长时间越短，其生理年龄也相应越老，越接越短，其生理年龄也相应越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官。近发育上的成熟，越易形成花器官。反之，越向基部，其生理年龄越小。反之，越向基部，其生理年龄越小。 一般情况下，幼年组织比老年组一般情况下，幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力。随着组织具有较高的形态发生能力。随着组织年龄的增加，器官的再生能力逐渐织年龄的增加，器官的再生能力逐渐减弱甚至完全失去再生能力。减弱甚至完全失去再生能力。第六，选择大小合适的外植体； 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5 1.00cm之间。如之间。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。第二节 外植体的消毒、接种 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理。 已消毒的外植体经无菌操作，接到培养基上，这一过程叫做接种。外植体接种的一般步骤：外植体的修剪流水冲洗浸润灭菌接种 将采来的植物材料除去不用的部分。 要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70酒精、消毒液、无菌水、手表等。1.将需要的部分仔细洗干净，可用适当的刷子刷洗。2.把材料切割成适当大小。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时。3.易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。4.洗衣粉、吐温可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质。 已消毒的外植体经无菌操作，接到培养基上。接种材料预处理接种材料预处理:(1)(1)接种材料预培养接种材料预培养(2)(2)就地套袋就地套袋(3)(3)接种材料修整接种材料修整(4)(4)冲洗冲洗接种前准备接种前准备:123456外植体消毒外植体消毒:外植体剪切外植体剪切:1.叶片叶片0.5cm0.5cm2.微茎尖微茎尖0.2-0.5mm3.带节茎段带节茎段0.5-1.0cm4.芽丛分离芽丛分离接种操作接种操作:横插法与竖插法横插法与竖插法: 接种时有一个敞口的过程，是极易引起污染的时期，主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，因此，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用13的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70的酒精或3的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。接种室要严格消毒 (1)在接种在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌；前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； (2)在接种前在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等；接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面；工作台面； 无菌操作可按以下步骤进行： (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； (6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；咳嗽等； (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。若连续接种，每若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。天要大强度灭菌一次。 接种前外植体消毒顺序接种前外植体消毒顺序:第三节第三节 培养条件培养条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组培苗的生长和发育。 不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25下的高。 桃胚在25条件进行一定时间的低温处理， 有利于提高胚培养成活率。用35处理草莓的茎尖分生组织35天，可得到无病毒苗。 一、温度 温度是组织培养过程中的重要因素。 组织培养在最适温度下生长分化表现良好， 大多数组织培养都是在2327之间进行，很多研究者采用了25的恒温条件。低于15时培养，组织会表现生长停止，高于35时对生长不利。 不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20、月季是2527、番茄是28。 温度不仅影响组培苗的生长速度， 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成28为最好， 在12以下，33以上形成率皆最低。 二、光照组织培养中光照也是重要的条件之一。1光照强度 从目前的研究情况看，光照强度对外植体、细胞的最初分裂增殖和器官的分化有重要影响。 一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。2光质 光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养，周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下， 几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。3光周期 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养， 最常用的周期是16小时的光照， 小时的黑暗，研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织， 在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养， 尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌桕树的愈伤组织。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发， 一般要求的相对湿度， 常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行；湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。 三、湿度 湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件。 容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。 前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量， 否则，将使培养基干硬，不利于外植体接触或插进培养基， 导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，封闭度较高的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。 培养基中添加的盐类、 蔗糖、甘露醇及聚乙二醇类高分子化合物，影响到渗透压的变化。 个大气压对生长有促进作用，个大气压以上就对生长有阻碍作用， 个大气压生长就完全停止，个大气压细胞就不能生存。 四、渗透压 五、pH值 p值适度因植物材料而异，不同的材料对培养基最适p值的要求也是不同的，大多在.左右，一般培养基皆掌握在.，这基本能适应大多植物培养的需要。表表 不同植物材料的最适不同植物材料的最适pH值值 一般来说当p值高于.时，培养基完全变硬；低于时，琼脂不能很好地凝固。由于高温灭菌会降低p值（约.个p）， 故在配制时常提高p值.单位。 p值大小调整可用.的a和.的l来调整。ml的a可使p值升高.单位，ml的HCL可使值降低.单位。调节时一定要充分搅拌均匀。 p值也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样， 后者较高一些。 氧气是组织培养中必需的因素。 瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。 通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥， 夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。 培养室要经常换气，改善室内的通气状况。 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。 六、气体污染的原因及其预防措施1 1、污染：、污染：植物组织培养植物组织培养过程中培养基和培养材过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养料滋生杂菌，导致培养失败的现象失败的现象2 2、污染的原因、污染的原因 一是病原菌污染（细菌、一是病原菌污染（细菌、真菌）真菌） 二是外植体、培养基、二是外植体、培养基、培养器皿带菌培养器皿带菌 三是操作人员未遵守操三是操作人员未遵守操作规程。作规程。真菌污染污染的预防措施 组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。预防措施有： 防止材料带菌-选择取材时间、材料与培养、外植体灭菌等措施； 防止用具带菌-器皿与金属器械灭菌； 操作室要处于无菌状态-工作室、培养室灭菌等； 操作人员要按照操作程序进行。 在培养基中加入抗菌素 分散接种假设污染率为假设污染率为95%： 100块材料，接种于块材料，接种于100支试管，即支试管，即1 1块块/ /支支。得率为：得率为：P=（1-95%）100=5块无菌材料块无菌材料 200块材料，接种于块材料，接种于100支试管，即支试管，即2 2块块/ /支支。P1（2污）污）=95% 95%=90.25%P2（1污污1得或得或1得得1污）污）=2 95%5%=9.5%P3（2得）得）=5% 5%=0.25%若得到若得到1支试管的无菌材料，至少要接种：支试管的无菌材料，至少要接种：1/0.25%=400支，即接种支，即接种800块材料，能得块材料，能得2块无菌块无菌材料。材料。 若按若按3 3块块/ /支支接种，需做接种，需做8000支试管培养基，接入支试管培养基，接入2.4万块万块材料，才能有材料，才能有1支试管的（得支试管的（得3块）无菌材料。块）无菌材料。六、外植体的褐变及其防止措施褐变褐变 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象影响褐变的因素 植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变高的植物易发生褐变 。 基因型：基因型： 外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻 。 培养基的成分：培养基中培养基的成分：培养基中6 6BABA或或KTKT能促进能促进褐变发生，而生长素类如褐变发生，而生长素类如IAAIAA可减轻褐变发生。可减轻褐变发生。 材料转移时间：材料转移时间：褐变的防止措施 选择适宜的外植体及最佳培养基：适当降低培养基无机盐浓度，降低PH值，降低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养物褐变 连续转移 加抗氧化剂：如硫代硫酸钠、抗坏血酸； 加活性碳 加多胺类物质，如精胺、亚精胺培养物的玻璃化现象及其预防措施培养物的玻璃化现象及其预防措施玻璃化现象及其产生原因 培养物增殖培养时，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，培养基中离子种类，比例不适，琼脂浓度低，不良培养环境如温度过低或过高，光照时间过长及通气不良，易造成组培苗含水量高，茎叶透明，出现畸形，发生玻璃化现象 玻璃化现象的预防措施 适当控制培养基中无机盐浓度 适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 增加自然光照，控制光照时间 控制好温度 改善培养皿的气体交换状况 在培养基中添加其他物质培养阶段易出现的其他问题白花苗1.苹果无融合生殖矮生砧木的组织培养2.矮牵牛花药培养及植株再生研究3.水稻花药组织培养中绿苗率的提高4.分蘖洋葱的组织培养与快速繁殖5.半夏组织培养快繁技术研究6.月季的茎段培养与快繁7.樱桃番茄的组织培养与快速繁殖8.哈密瓜组织培养和离体快繁9.羽扇豆的组织培养10.花烛的组织培养与快速繁殖11.柿树的叶片培养和快速繁殖12.菊苣花瓣的组织培养文献资料文献资料:复习思考题：复习思考题：1选择外植体时应注意的问题有哪些？选择外植体时应注意的问题有哪些？2外植体消毒的整个过程。外植体消毒的整个过程。3接种时需要注意哪些问题？接种时需要注意哪些问题？