年产3万吨红曲色素生产工艺设计＿毕业设计

中北大学2013届毕业设计说明书年产3万吨红曲色素生产工艺设计摘要：红曲色素是一种优良的色素，是红曲在菌体生长代谢过程中产生的天然色素，具有较高的营养价值和药用价值，目前广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等领域。本设计以从土壤中筛选的红曲霉为出发菌株，通过紫外线超声波复合诱变选育出红曲色素高产菌株，通过摇瓶筛选和稳定性试验，得到稳定性高产红曲色素的突变菌株。在此基础上，尝试了三级发酵的发酵方式，优化了培养基，确定了发酵工艺条件：接种菌龄20h、接种量5%、初始pH5.0、培养最适温度32及发酵时间96h，并选择了合适下游提取工艺。设计的生产工艺稳定、简便，发酵后所得的红曲色素产量达到300g/L。关键词：红曲霉，红曲色素，发酵，诱变Abstract：Monascus pigment is a good natural pigment, which Monascus pigment in the cell growth in the metabolism process produces, has high nutritional value and medicinal value, is now widely used in the fields of medicine, food, feed and cosmetics etcThe design of the screening from the soil of Monascus as starting strain, through ultraviolet ultrasonic compound mutation breeding of the monascus pigment producing strains, through shake flask screening and stability test, the stability of mutant strains obtained high yield of Monascus pigment. On this basis, try the fermentation level three fermentation, optimization of the culture medium, fermentation conditions were determined: inoculating age 20h, 5% inoculation quantity, initial pH5.0, culture optimum temperature is 32 and the fermentation time was 96h, and select the appropriate downstream extraction process. Design of production process stability, simple, after fermentation of Monascus pigment yield income reached 300g/L.Keywords: Monascus, Monascus pigment, fermentation, mutation目录1引言11.1 概述11.2 发酵方式11.3 红曲色素合成机理11.4 国内外研究现状21.4.1 国内研究现状21.4.2 国外研究现状31.5 本课题的意义42红曲霉菌种的选育52.1红曲色素生产菌52.2菌种描述52.3色价分析方法52.4 诱变选育52.4.1复合诱变52.4.2摇瓶筛选62.4.3 稳定性试验62.5 菌种保藏63 培养基73.1红曲霉的培养基73.2 培养基的设计73.2.1 碳源73.2.2 氮源73.2.3 无机盐及微量元素84 灭菌94.1 仪器灭菌94.2 培养基灭菌94.2.1分批灭菌104.2.2连续灭菌104.3 空气除菌104.4 发酵罐灭菌105 种子扩大培养和装料发酵115.1 斜面培养115.2 一级种子培养115.3 二级种子培养115.4 装料发酵126 发酵控制136.1 pH值的控制136.3 溶氧的控制136.4 补料工艺的控制136.4.1磷酸与氨水146.4.2 葡萄糖与蛋白胨147 下游加工167.1下游加工工艺的一般流程167.2发酵液的预处理与固液分离167.3提取167.31 胞外色素167.3.2 胞内色素167.4 成品加工与包装168 物料衡算188.1 发酵罐数量衡算188.2 发酵液组成衡算198.3 发酵罐工艺设计199 结果与讨论21致谢25第I页 共页1引言1.1 概述红曲色素，是以大米、大豆为主要原料，经红曲霉菌液体发酵培养、提取、浓缩、精制而成及以红曲米为原料，经萃取、浓缩、精制而成的天然红色色素。作为天然色素，红曲色素一直以来被认为是安全性较高的食用色素，试验已证明不含黄曲霉毒素。动物性试验表明，使用红曲色素及其制品的食物均未发现急、慢性中毒现象，也无致突变作用。此外，还具有降低血脂、血压，抗突变，防腐、保鲜等生理活性，因此红曲色素具有“天然、营养、多功能”的多重优点1。本草纲目中记载，红曲消食活血，健脾燥胃，治赤白痢，下水谷，治打扑伤损，治女人血气痛及产后恶血不尽。近年来，随着国内外学者对红曲色素研究的深入，其应用范围也在不断扩大。1.2 发酵方式目前红曲生产主要有两种工艺，一种是我国的传统工艺，即固体发酵工艺，固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水下溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。从生物反应过程中的本质考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程。固体发酵具有操作简便、能耗低、发酵过程容易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积的污染等优点。其生产环境卫生条件差，种子纯度低，生产周期长，机械化程度低，产品色阶低，产品次品率高，出口率低。无法满足功能性红曲全程无菌的工艺条件2。另一种是液体深层发酵生产红曲色素，是指在生化反应器中，模仿自然界将食药用菌在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行菌丝大量培养繁殖的过程。工业化大规模的发酵培养即为发酵生产，亦称深层培养或沉没培养25。此工艺自动化程度高，污染小，色素粉色价高，但设备投资大，生产成本高，且规模小，另外该工艺只能生产红曲红色素。1.3 红曲色素合成机理红曲色素一直是国内外学者研究的焦点，但是其合成机理尚未研究清楚。不同氨基酸和短链脂肪酸等对色素合成的影响，结果表明缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸以及乙酸、丙酸等具有前体的作用，能够刺激色素的生产，而且它们都具有转化为聚酮合成前体的共同特征。所以聚酮途径被认为是红曲色素合成的主要途径。赵树欣等4考察了红曲霉的代谢途径，认为其代谢包括初级代谢和次级代谢。初级代谢主要产生不饱和脂肪酸、醇、酯等芳香化合物，次级代谢的产物主要有红曲色素、Monacolin K、降血脂药物-氨基丁酸、桔霉素(Citrinin)、天然抗氧化剂黄酮酚等。次级代谢产物红曲色素的生物合成为1分子乙酰CoA和3分子丙二酰CoA在聚酮体合成酶(Polyketide syntheses PKSs)的作用下生成四酮化合物，四酮化合物再与1分子丙二酰CoA生成五酮化合物，如此循环，使酮级化合物碳链加长，最后生成红曲色素。1.4 国内外研究现状1.4.1 国内研究现状红曲色素是红曲菌代谢过程中产生的一系列聚酮化合物的混合物,组成较复杂。使用不同的红曲菌株、培养基、发酵条件所产生的红曲色素组成有较大差异,因而其生成途径也有不同。长期以来，我国及东南亚一些国家和地区多采用传统的固态发酵法，且较多的停留在手工作坊形式。该方法生产红曲色素能耗低、设备要求简单、成本较低、废水废渣少、不易造成二次污染，但是操作繁琐，劳动强度大，生产周期长且产品质量稳定性不高，不适宜大规模机械化生产。20世纪80年代我国朱文锦等9研究报道了厚层机械通风制曲工艺以改进传统的固态发酵生产，该工艺是在纯种制曲工艺基础上，采用以池代窑，改人工翻曲为机械通风、自动控温的办法, 使红曲的生产达到机械化、纯种化，生产周期从原来的7d缩短到5d。近年来，我国还创新性地采用了适合大型红曲厂的圆盘固体发酵法，采用圆盘固体发酵制曲设备与种子罐、蒸饭机、干燥机配套，提高了其机械化、自动化水平，实现了固态法生产红曲的机械化。黄前美等10用红曲霉3532菌种，以价格低廉的马铃薯、造纸工业废弃物甘蔗渣和生产特级面粉的副产物普副粉为原料，添加适量的无机氮源以代替大米,进行固态发酵生产红曲色素, 色素产量可提高10%。刘玺等11以小米为原料, 研究了液态发酵生产红曲色素的发酵培养基组配及相关工艺参数的选择, 结果显示以小米为原料，经制醪后液态发酵生产比固态发酵产率高、耗能低, 产品使用方便。目前，我国红曲色素发酵的生产设备，色素的后期提取工艺水平及精炼工艺还比较落后。菌种产色水平较低、色素生产成本较高是红曲色素目前还不能在食品中广泛使用的主要原因之一。通过菌种诱变选育提高生产菌株的发酵水平，降低生产成本，对我国色素产业的提升有着重要的意义。红曲霉为出发菌株，通过紫外线、酸及高温处理，并采用定向筛选，从大量菌株中筛选出一株高色价、高稳定性菌株，其色调紫红，色价水平明显优于原生产菌株。印红等14在空间飞行对红曲霉菌产量的影响上做了尝试，利用神舟三号返回舱搭载红曲霉菌，获得了高产Monacolin的菌株。该实验选用一种效果好、设备简单又对人体无伤害的紫外诱变对红曲红色素生产菌株CICC5017进行紫外诱变以获得红曲红色素高产菌株，再以廉价的玉米为原料通过固态和液态发酵筛选及传代稳定性实验，来获得红曲红色素产量高、生长速度快、遗传性状稳定、培养要求低、工艺简单的优良菌株，以供工业化生产所需29。1.4.2 国外研究现状有关红曲色素的现代研究日本起步较早，从1890年便开始对其进行分离研究，20世纪30年代红曲色素传到了欧美，之后各国相继开始了对红曲菌的分类鉴定、红曲色素发酵提取工艺及生产应用等方面的研究，对其组分分离、结构鉴定及代谢机制等方面也开展了一些工作，但研究进展缓慢。近10多年来,随着微生物学的发展，中外的专家学者对红曲色素进行了大量广泛而深入的研究，在红曲色素分离、结构鉴定及改性、生成机制、菌种改良、液态发酵工艺优化、代谢产物基因调控、功能性及安全性等理论和应用方面的研究都卓有成效，不断拓展着红曲色素的应用领域17。20世纪90年代以来国内外在红曲色素的液态发酵生产方面做了大量工作，研究已取得突破性进展。液态发酵生产的红曲色素,主要成分是水溶性的“复合色素”。采用这种生产方式具有周期短、产量高、杂质少、产品质量稳定等优点，有助于实现生产自动化， 提高产品质量稳定性,扩大生产规模。液态发酵法生产的红曲色素色价偏低，这是制约其工业化生产的重要原因之一，为此，国内外广泛开展了液态发酵菌种改良和工艺条件优化的研究。目前，提高红曲色素色价的途径主要有: 提高红曲菌的生物量、添加促进色素形成的物质等，具体措施有：菌种诱变、固定化细胞技术、葡萄糖流加培养、菌种联合培养、添加抗氧化剂和金属离子、添加植物油、青霉素以及使用超声波处理等。另外，红曲色素发酵生产中使用的原料多以大米或饴糖、葡萄糖、淀粉、大豆蛋白粉等为主，导致粮食消耗量大或生产的综合成本较高，目前国内外已开发利用马铃薯、玉米、小米等为主要原料进行生产的研究18。Silvana等19以葡萄皮籽为原料，研究确定了液态发酵生产红曲色素的工艺条件。由此可见，以农业工业废弃物为原料生产红曲色素有很大的潜力，这将是红曲色素生产的发展方向之一。1.5 本课题的意义红曲色素是红曲在菌体生长代谢过程中产生的天然色素，与其它天然色素相比，具有热稳定性好，蛋白着色力强，色调柔和，对酸碱稳定，还可以提高加工制品对光和氧稳定等优点。而且红曲色素无毒性、无致突变作用，安全性很高。另外，研究发现红曲色素是多种色素成分的混合物，从红色红曲霉产生的色素中还可分离提纯出两种新的红曲色素。因此红曲可提供性能稳定、安全性高、品种多样的天然色素。红曲色素符合食品着色剂“天然、营养、多功能”的发展方向，具有很好的应用前景。2红曲霉菌种的选育2.1红曲色素生产菌本设计以从土壤中筛选得到的红曲霉菌株为出发菌株，经紫外线和超声波复合诱变，筛选得到了得到高产红曲色素的菌株。2.2菌种描述红曲霉在麦芽汁琼脂培养基上生长良好，菌落初为白色，老熟后变成淡粉色、紫色或灰黑色。红曲霉菌丝体的大量分枝的顶端产生单个或成串的分生孢子，孢子呈球形或椭圆形，闭囊壳橙红色，近球形，含有多数子囊，子囊内含8个孢子，子囊孢子卵形或近球形，光滑，透明，无色或漆红色。红曲霉能在1545生长，最适生长温度为3235，最适生长pH为5.06.0，有良好的耐酸和耐乙醇能力。能利用淀粉、糊精、麦芽糖、蜜二糖、纤维二糖、葡萄糖、甘油、乙醇、乳酸、苹果酸、柠檬酸等多种糖类和酸类作为碳源，能利用硝基氮、氨基氮和有机氮。红曲霉能自身合成生物素、硫胺素、核黄素、麦角固醇等多种维生素。红曲霉可代谢生成多种酶类，有葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。2.3色价分析方法液态发酵样品用滤纸过滤得滤液和滤渣，滤液经适当稀释后用721型分光光度计于510 nm处测定OD值，滤渣用蒸馏水洗涤3次后于60烘干称重测得生物量，然后称取1g干菌丝用75%的乙醇浸提2次，每次2h，过滤，合并后的滤液适当稀释后用721型分光光度计于510 nm处测定OD值。色价=稀释倍数OD值。2.4 诱变选育 选育过程：复合诱变流程：出发菌株超声波诱变平板分离紫外诱变平板分离稳定性试验对比试验孢子悬浮液的制备：菌株在33斜面培养4d后，用无菌生理盐水洗下红曲霉孢子，倒入已灭菌的装有2030颗玻璃珠的三角瓶中，放入摇床中220r/min 振荡1h，孢子分散均匀即可。用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成孢子悬浮液，浓度稀释至l06个/mL，以备用。2.4.1复合诱变（1）超声波诱变：将9支装有菌悬液的试管放入超声波清洗仪的工作箱内，调整超声波功率为500w ，分别作用5min45min后，取出试管即刻放到冰水中冷却，防止超声波产热杀死孢子。将所得孢子悬液稀释l06倍涂布，32的培养箱中培养3d后观测、计数，对诱变后的菌株进行筛选。（2）紫外诱变：将经超声波诱变筛选好的菌株进行孢子悬浮液的配制，取浓度为1.0 106个/mL红曲霉孢子悬浮液5mL，加入直径90mm的无菌培养皿中，先预热紫外灯30min，然后开启平皿盖于磁力搅拌下分别处理1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min（15W，30cm），然后稀释至l0-5倍，分别吸取3个稀释度的孢子悬浮液各0.2mL涂布平板，培养3d4d后，计算致死率（紫外诱变致死的孢子数与未经诱变总孢子数的比值）和正突变率（菌落直径与扩散圈直径比值比未经诱变的菌落直径与扩散圈直径比值小的为正突变的菌落，正突变的菌株与总菌株个数的比值称正突变）。以致死率70%80%、正突变率最高为最适突变剂量，以最佳剂量处理孢子悬浮液，涂布平板，挑去单菌落进行摇瓶筛选23。2.4.2摇瓶筛选（1）小瓶发酵初筛：斜面培养5d7d，待孢子成熟，接种于装有20mL发酵培养基的250mL三角瓶中，220r/min、32培养96 h。重复接种3瓶。根据生物量高的58株用于复筛和菌种保藏。 （2）大瓶复发酵复筛：用初筛出的58株菌的成熟斜面孢子接种于装有80mL种子培养基的500mL三角瓶中，220r/min，32培养48h，得种子液。取种子液8mL10mL接种于装有80mL100mL 发酵培养基的500mL三角瓶中，220r/min、32培养96h。根据提取红曲色素产量高筛选出12株用于下一轮诱变处理22。2.4.3 稳定性试验 将诱变后的菌株传代10次，每代都进行摇瓶发酵试验，产量稳定的则其性能可能稳定。2.5 菌种保藏其原理是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子和菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。菌种保藏的方法有：斜面冰箱保藏法、砂土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。对于红曲霉采用斜面冰箱保藏法。3 培养基3.1红曲霉的培养基A：斜面培养基：可溶性淀粉3%，葡萄糖6%，蛋白胨2%，琼脂3%，自来水，乳酸调节pH值至5.0，121高压灭菌30 min。B：种子培养基：早籼稻米粉3%，NaNO3 0.5%，KH2P04 0.15%，MgS04 0.1%，自来水，乳酸调节pH值至5.06.0，121高压灭菌30 min。C：基本发酵培养基：大米粉9%，葡萄糖7%，蛋白胨2%，NaNO3 0.2%，KH2P04 0.1%，MgS04 0.2%，pH 5.0 6.0，121高压灭菌30 min。D：补料培养基： 补料1：25%28%氨水，使pH保持在设定范围内。补料2：80%磷酸，使pH保持在设定范围内。补料3：葡萄糖20%，蛋白胨2%，NaNO3 0.2%，KH2P04 0.1%，MgS04 0.2%，pH 5.0 6.0。3.2 培养基的设计3.2.1 碳源碳源是发酵培养基中最重要的组分之一，是微生物代谢的能量来源。葡萄糖作为发酵培养基中的碳源时，最终所得的红曲色素色阶高于蔗糖、麦芽糖和大米粉为碳源下的。但是因为大米粉市场价格明显低于葡萄糖价格，两者差距不大，因此，宜选用大米粉作为红曲霉发酵培养基中的碳源。在红曲霉产红曲色素的发酵过程中，由于碳源的补加促进了菌体的生长，从而促进了红曲色素色阶的提高。值得注意的是，尽管补加蔗糖所得的菌体量显著高于补加葡萄糖方案条件下的菌体量，但是其红曲色素色阶却显著低于补加葡萄糖的方案。虽然补加麦芽糖得到的红曲色素色阶高于补加葡萄糖的方案，但是二者之问无差异显著性。综合原料成本，宜选用葡萄糖作为红曲霉最佳的补加碳源。3.2.2 氮源氮源是构成细胞中所含蛋白质、核酸、酶等成分，以及代谢产物中氮素来源的营养物质，所有红曲霉在生长时均可利用无机氮源。工业生产中通常使用的氮源有氨、铵盐和尿素。当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。常用的氮源有有机氮源和无机氮源两大类。黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、菌丝体和酒糟等都是有机氮源。无机氮源有氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等。氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，因此是菌体生长以及代谢产物形成所必需的。为探索出红曲霉发酵培养基中的最佳氮源，选用蛋白胨作为氮源，其对应的红曲色素色阶显著高于其它氮源下所得的红曲色素色阶。但蛋白胨市场价格高于硝酸钠等氮源物质，用硝酸钠替代后结果差异不是很大，因此选用硝酸钠作为红曲霉发酵的氮源。3.2.3 无机盐及微量元素无机盐类是微生物必不可少的一类物质，它们为微生物的正常代谢提供多种重要的生理功能。硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸锰等无机盐类对红曲霉发酵产红曲色素的测定结果，当发酵培养基中添加磷酸二氢钾，硫酸镁时所得的红曲色素色阶显著高于不添加任何无机盐类的试验方案。因此，磷酸二氢钾，硫酸镁对红曲色素的合成具有显著的促进作用。4 灭菌所谓灭菌，是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。应用的范围有：（1）培养基灭菌；（2）气体灭菌；（3）设备及管道灭菌等。常用的灭菌方法有以下几种：a、化学灭菌；b、射线灭菌；c、干热灭菌；d、湿热灭菌；e、过滤灭菌。化学灭菌：由于化学药剂会与培养基中的一些成分作用，而且加入培养基后不易去除，所以化学灭菌不用于培养基的灭菌。但染菌后的培养基可以用化学药剂处理。射线灭菌：紫外线的穿透力低，所以仅用于表面消毒和空气的消毒。湿热灭菌：灭菌原理是直接用蒸汽灭菌，蒸汽在冷凝时能释放出大量潜热，蒸汽具有强大的穿透力，破坏菌体蛋白和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。水煮常压灭菌：100。或饱和蒸汽灭菌：一般121，30分钟。适合培养基和发酵设备灭菌。干热灭菌：灭菌原理是利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用灼烧和电热箱加热，140180、12小时。适于对玻璃及金属用具及沙土管灭菌。过滤除菌：除菌原理是利用微生物不能透过滤膜除菌。方法是使用0.010.45 mm孔径滤膜，用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。4.1 仪器灭菌在发酵操作过程中，种子活化、扩大培养需要接种环、摇瓶、试管等仪器。接种环应用火焰灼烧法灭菌；摇瓶、试管应用蒸煮法灭菌。经过灭菌的仪器不要暴露于空气中或于其它的未知仪器接触，并及时使用，以免再次带菌。4.2 培养基灭菌对于培养基灭菌大多采用湿热灭菌，即利用饱和水蒸气有很强的穿透力，而且在冷凝时放出大量冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭各种微生物。同时蒸汽的价格低廉，来源方便，灭菌效果可靠，所以培养基灭菌，发酵设备及管道的灭菌，试验用材料的灭菌，普遍采用这种灭菌方法。通常的蒸汽灭菌条件是在121（表压约0.1MPa）维持30min。4.2.1分批灭菌 是将先配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程（适用于小型发酵罐）。4.2.2连续灭菌连续灭菌也叫连消，就是将将配制好的并经预热的培养基用泵连续输入由直接蒸汽加热的加热塔，使其在短时间内达到灭菌温度（126132）。然后进入维持罐（或维持管），使在灭菌温度下维持57分钟后再进入冷却管，使其冷却至接种温度并直接进入已事先灭菌（空罐灭菌）过的发酵罐内。其过程均包括加热、维持和冷却等灭菌操作过程。连续灭菌的连续性强，快速灭菌消毒，培养基营养成分破坏少，适用于大容积发酵罐物料的连续灭菌消毒。加热时间短，提高了热的利用率；操作条件恒定，灭菌质量稳定；易于实现管道化和自控操作；发酵设备利用率高。由此可见，无论在理论上或者在实践上，连续灭菌的优点十分明显，因此本设计采用培养基连续灭菌。4.3 空气除菌大多数生物培养基都需要氧气，通常以空气作为氧源。根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求8。过滤是空气除菌的主要手段，按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类：绝对过滤，相对过滤。后者主要原理为：（1）惯性滞留作用（2）拦截滞留作用（3）布朗扩散作用（4）重力沉降（5）静电作用。本设计发酵需要的空气无菌程度高，因此采用高效前置过滤空气除菌。高效前置过滤除菌是利用压缩机的抽吸作用，使空气先经中、高效过滤后，再进入空气压缩机，这样就降低了主过滤器的负荷。特点是采用了高效率的前置过滤设备，使空气经过多次过滤，因而所得的空气无菌程度比较高。4.4 发酵罐灭菌空罐灭菌方法：通入蒸气，使罐内蒸气压力达0.147MPa，维持45min。灭菌过程从阀门，边阀排除空气，并使蒸气通过达到死角灭菌。灭菌完毕，关闭蒸气后，待管内压力低于空气过滤器时，通入无菌空气保压0.098MPa。5 种子扩大培养和装料发酵根据菌种生长特性，为得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物，故采用三级级发酵。5.1 斜面培养菌种的斜面培养必须有利于菌种的生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。5.2 一级种子培养一级种子罐制备，是指将来自三角瓶瓶培养的菌体，打开接种口在火焰保护下接种到3台100L的种子罐中培养，接种量为种子罐内的培养基量的10%，培养12h。其目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分、多含有机氮为主，有利于长菌。一级种子质量要求：种龄：12hpH值：50.1光密度：OD净增值0.5以上残糖：0.5%以下 无菌检查：(-)噬菌体检查：(-)镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐5.3 二级种子培养为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。经质检合格可移种至发酵罐(或冷却至10备用)。二级种子的质量要求种龄：78hpH：5.0左右光密度：OD净增值0.5左右残糖：1.5%左右无菌检查(-)噬菌体检查(-)5.4 装料发酵首先将已通过连续灭菌的发酵培养基泵入已空罐灭菌的发酵罐中，装料系数为75%，当发酵罐中温度降至37左右时，再将二级种子罐中的种子液用空气压差法接种以5%的接种量接入到此发酵罐中，将通气量调至1:1vvm，罐压保持在0.040.06MPa进行发酵。6 发酵控制6.1 pH值的控制红曲霉的最适生长pH为5.06.0，初步确定红曲霉生长阶段pH控制在5.0。补料与补料完毕后控制在8.0，在此pH下，红曲霉的后期代谢产物会开始大量合成，使红曲色素能够更好的积累。6.2 温度的控制红曲霉发酵是一个产热过程，在对数生长阶段会产生大量的热，使温度上升；而在菌体生长的后期，由于菌体代谢活力的下降，温度反而会下降。由于红曲红曲霉酶活性对温度的变化极为敏感，太高或太低都会影响其合成红曲色素的能力，红曲霉发酵一般温度控制在30左右，在摇瓶发酵实验结果的基础上，本工艺采用2830的发酵温度，该发酵罐可以自动控制温度在设定值。6.3 溶氧的控制根据参考资料25，发酵过程中溶氧值不能低于20%，在发酵初期，通过增加转速和提高通气量可以让溶氧维持在这一水平以上，而在后期单靠提高转速和通气量已经不能满足溶氧的需求时，可以通过联合控制补料速度的方法来提高溶氧。但是通过实验发现，如果提供太好的溶氧条件，菌体生长过于旺盛，菌体老化严重，甚至部分死亡的现象，不利于产物的积累。降低流加碳源的速度，会降低菌体的比生长速度，溶氧会随之提高，即溶氧值与碳源流加速度呈反相关。因此该发酵工艺对溶氧的控制方案为：在开始培养阶段，通过提高转速和通气控制溶氧；在后期培养补料阶段，在保持稳定的通气和搅拌的条件下，通过控制补料的速度来控制溶氧。6.4 补料工艺的控制补料一般是在发酵进行至大量生成产物的阶段，因合成产物和维持细胞活动的需要,有选择地补充营养物质。合适的补料工艺能够有效地控制微生物的中间代谢,使之向着有利于产物积累的方向发展。补料发酵补加的营养物质大致有五类：(1)补充菌体所需的能源和碳源，如葡萄糖和液化淀粉等；(2)补充菌体所需氮源,如蛋白胨、豆饼粉、玉米浆、酵母粉和尿素等有机氮源，有些发酵还采取通入氨气或添加氨水等；(3)加入某些菌体生长代谢所需的微量元素和无机盐，如磷酸盐、硫酸盐等；(4)对于产诱导酶的微生物，常在补料中适当加入该酶的作用底物,以提高酶的产量；(5)对一些抗生素发酵，往往需要补充抗生素形成的前体。本设计补充菌体所需能源为葡萄糖，有机氮源为蛋白胨，无机氮源为NaNO3和氨水，无机盐和微量元素为KH2P04、MgS04 等。6.4.1磷酸与氨水pH调控是通过补加磷酸和氨水来实现的，在发酵过程中，不同的阶段设定好不同的pH值，发酵罐自动控制补加磷酸和氨水的速度，使pH维持在某一恒定值，同时提供补充了发酵过程中所需的磷源和氮源。6.4.2 葡萄糖与蛋白胨葡萄糖补加浓度对菌体生长及红曲色素合成的影响，葡萄糖不同浓度方案下最终所得的红曲色素色阶分别为(94.21.4)U/mL、(162.92.5)U/mL、(295.12.7)U/mL和(200.63.5)U/mL。在摇瓶发酵过程中，随着葡萄糖补加浓度逐渐增加至20%发酵液，所得到的红曲色素色阶也呈上升之势。但是随着葡萄糖补加浓度进一步增大，最终红曲色素色阶呈现下降趋势。这表明，在红曲霉发酵产红曲色素的过程中，过高浓度葡萄糖的补加就可能会对红曲色素的合成产生阻遏或抑制效应。氮源是发酵培养基中最重要的组分之一，用于菌体的量菌体均显著高于不补加蛋白胨条件下所得的菌体量，而且随着蛋白胨补加浓度的增加，菌体生物量也呈现明显的增加趋势。这说明补加蛋白胨能显著地促进红曲霉的菌体生长。当蛋白胨每次补加量达2%发酵液时，最终的红曲色素色阶在所有实验方案中最高，达到(33.68.7)U/mL，显著高于不补加蛋白胨条件下所得的红曲色素色阶(3l1.04.5)U/mL。与菌体量变化趋势不同的是，蛋白胨补加量为4%6%发酵液时，其最终所得的红曲色素色阶反而显著低于不加蛋白胨的方案。其原因可能是在发酵过程中蛋白胨能明显促进红曲霉的菌体生长，但是会对红曲色素的合成产生一定的负作用，尤其是补加浓度过高会显著降低红曲色素的合成。这说明，为了提高红曲色素的色阶，发酵过程氮源的补加是一个关键的工艺控制参数。6.5 发酵时间接种后，菌体生长24h左右，溶氧会出现一个大的上升，说明此时起始培养基中的碳源已基本被消耗完。之后开始添加补料培养基，流速20mL/h。每隔12h取样测定红曲色素的含量，当其达到最高时发酵结束，下罐。补料阶段持续约50h。补料完毕再继续发酵24h，故整个发酵周期为96h左右。发酵罐开始发酵后，每隔12小时取样测定生物量(菌体湿重)，发酵液的OD660以及发酵液中红曲色素的含量。当发酵约90h时，产物红曲色素含量达到最高的300g/L。再延长发酵时间，红曲色素的产量与菌体生物量已经基本不在增加，且生物量有一些下降，考虑可能是由于菌体的自溶造成。7 下游加工 7.1下游加工工艺的一般流程一般产品的分离提取工艺含以下步骤：发酵液预处理、固液分离、产品初步提取、产品精制。红曲色素70%80%存在于菌体内，2030%分泌到发酵液中，存在于发酵液中的色素即胞外色素多为水溶性色素，菌体内的色素即胞内色素多为醇溶性色素，菌体内红曲色素的提取效果好坏直接关系到红曲色素提取效率的高低，目前菌体内红曲色素的提取主要采用传统乙醇浸提法。7.2发酵液的预处理与固液分离发酵液中的红曲色素浓度一般在20%左右，为水溶性产物，收集需固液分离，固液分离收率10%20%；醇溶性红曲色素为菌体内产物，提取要收集菌丝体，然后需要用乙醇进行抽提，乙醇抽提率70%。预处理收率在89%93%。7.3提取发酵罐培养板框压滤浸泡滤渣（用70%80%酒精浸泡搅拌约2638h）再次压滤真空浓缩（回收酒精）喷雾干燥（粉状红曲红）7.31 胞外色素发酵液中的红曲色素浓度比较低，一般为2030%左右，为红曲霉菌体外产物，属于水溶性红曲色素，发酵后可将发酵液进行板框压滤或离心分离27，收集滤液。7.3.2 胞内色素红曲霉菌体内红曲色素为醇溶性色素，为保证提取完全，固液分离后的滤渣用70%80%的乙醇进行多次提取，乙醇浓度与pH值对提取率有影响，在乙醇浓度较低时，升高pH有利于色素溶出，而乙醇浓度较高时，降低pH有利于色素溶出。为节约成本，本设计采用较低浓度乙醇升高pH来溶出红曲色素。所得滤液与发酵液分离后的胞外色素澄清滤液合并，回收酒精后浓缩，再进行喷雾干燥成粉28。7.4 成品加工与包装精制液用(NH2)2SO4调至pH6.06.5，经过GLP25离心式喷雾干燥机（蒸发能力25kgH20/h、最高转速25000rpm、高度5m、进风温度40100）干燥得成品。精制液经置于塔顶部的高速离心雾化器，雾化成极细微的雾状液珠，空气经过过滤和加热，进入干燥器顶部空气分配器，热空气呈螺旋状均匀地进入干燥室。液珠与经分布器分布后的热空气在干燥塔内混合，迅速进行热质交换，在极短的时间内干燥成为粉状产品。成品连续地由干燥塔底部和旋风分离器中输出，废气由引风机排空，最后得到成品30。但需要经进一步的包装才能方便于运输及保存。其中回收率为74%左右。8 物料衡算8.1 发酵罐数量衡算本设计是年产3万吨的红曲色素的工艺设计。本设计中红曲色素的发酵周期约为4d(菌体生长24h左右，补料阶段持续约50h，补料完毕再继续发酵24h)。一年的工作日有200d，红曲色素的发酵周期为4d，其中空罐灭菌时间为3h，装料时间为12h，放罐时间为6h。而清理发酵罐需要1d。除去其他考虑情况，发酵次数可以达到33次。每次的生产任务是909吨红曲色素。以下采用逆推法计算一个批次发酵罐的个数。在喷雾干燥前，一个批次红曲色素初精制液的总质量为：90996%=947 t醇溶性红曲色素所占比例为：94780%=758t水溶性红曲色素所占比例： 94720%=189t醇溶性红曲色素用乙醇抽提前的质量： 75870%=1083t水溶性红曲色素精致前的质量： 18915%=1260t发酵液固液分离前的质量为: 1083+1260=2343t红曲色素在经过板框过滤处理前的总发酵溶液量为： 234390%=2603t预处理之前的混合液的质量为： 260390%=2892t放罐前，发酵液的质量为： 289285%=3402t也就是一批次发酵完毕后发酵液的总量。忽略发酵液发酵前后的体积变化，红曲色素的含量为300g/L30，发酵液的总体积为： 3402300=11342.05m3又因为发酵罐的装料系数取为0.75故需要的总罐体积为：11342.050.75=15122.73m3本设计采用的是400m3的发酵罐，故发酵罐的个数为：15122.73400=38个8.2 发酵液组成衡算400m3发酵罐的装料系数为0.75，则该罐的装料为：4000.75=300m3因为发酵培养液的组成(%)为：大米粉9%，豆饼粉2%，NaNO3 0.2%，KH2P04 0.1%，MgS04 0.2%。因此，每个罐的大米粉用量为： 34021000389%=8057kg400m3发酵罐的豆饼粉用量：30421000382%=1791kg400m3发酵罐的NaNO3 用量：34021000380.2%=179kg400m3发酵罐的KH2P04用量：34021000380.1%=89.53kg400m3发酵罐的MgS04用量：34021000380.2%=179kg8.3 发酵罐工艺设计发酵罐中，高径比为1.74，取H/D=2.5；搅拌器直径为1/3直径；取d/D=1/3；档板为0.1倍直径，取d1/D=0.1；下部搅拌器到底部距离为：B/D=1；S/D=2.5；W/D=1/8由公式V=D2H+2(hb+D/6)/4，H=2.5D，hb可忽略，V=400m3，代入得2.225D3=400，得出：D=5.64mH=2.55.64=14.1md=5.64/3=1.88md1=0.15.64=0.564mW=5.64/8=0.705mB=D=5.64mS=2.54.5/3=3.8m其中：H：发酵罐筒身高 D：发酵罐内径d：搅拌器直径 W：档板B：下搅拌浆距底部距离 S：两搅拌浆之间的距离本发酵过程中选用机械搅拌式发酵罐，发酵罐的搅拌器一般都采用具有圆盘的涡轮搅拌器，搅拌叶的型式由平叶、弯叶、箭叶三种，通常有六个叶片均匀排列在圆盘上，搅拌叶型的选择是发酵罐设计中的一个关键，我国由于种种原因，普遍采用六弯叶或六箭叶圆盘涡轮式。9 结果与讨论（1）本设计利用从土壤中筛选的红曲霉菌株，经过紫外线诱变和超声波复合诱变，得到的高产红曲色素的正向突变菌株。（2）对培养基进行优化。在红曲霉发酵生产红曲色素中，以乳糖最佳，葡萄糖次之，蔗糖最差。由于乳糖的市场价高于葡萄糖，而乳糖发酵生产红曲色素的能力与葡萄糖相比，差异并不显著，因此碳源我们最终选择了7%的葡萄糖；在无机氮源和有机氮源中，NaNO3和蛋白胨累积红曲色素的产量最高，因此我们分别选择NaNO3作为无机氮源，蛋白胨为有机氮源进行设计；由于过高的无机离子浓度抑制了菌体的生长，使菌体不能大量生长繁殖而影响了红曲色素的合成，因此无机离子浓度不易过高。（3）对培养条件的优化。利用红曲霉发酵红曲色素，pH值对红曲色素尤其重要，因为它直接影响红曲色素合成酶的酶促反应。由于初始pH在4.0时其OD660为最高和pH在6.0时红曲色素累积量达到最高，说明红曲霉在酸性条件下能更好的生长；发酵过程中pH的控制是通过发酵罐自动补加磷酸和氨水来实现的。参考摇瓶发酵实验结果初步确定生长阶段pH控制在5.0。补料与补料完毕后控制在8.0，使红曲色素能够更好的积累。由于红曲色素合成酶的活性对温度的变化较为敏感，太高或太低都会影响其合成红曲色素的能力，同时过高或过低的温度对菌体的生长也有明显的影响，因此在发酵过程中温度的控制是非常重要的。由于红曲霉在温度为32时产红曲色素的量最高，发酵温度低于或高于32都对菌体累积红曲色素有不利影响，故32为最佳温度16。本工艺采用32左右的发酵温度，该发酵罐可以自动控制温度在设定值。红曲霉发酵属于液态深层好气性发酵，培养过程中需要用大量无菌压缩空气。而氧在水中的溶存量是微量的，在0.1MPa压力20下，仅能溶解1.38mol/L左右，据Finn26的报道，该值仅能满足一般浓度的菌体生存15min，因此发酵过程中，随着氧被菌体不断利用，要连续通入无菌空气，氧由气相溶解到液相，然后经过液流传给细胞壁进入细胞体内，以维持菌的生长和目的产物的合成。因此利用红曲霉生产红曲色素的过程中，必须在好氧的条件下进行。因此该发酵工艺对溶氧的控制方案为：在开始培养阶段，通过提高转速和通气控制溶氧；在后期培养补料阶段，在保持稳定的通气和搅拌的条件下，通过控制补料的速度来控制溶氧。（4）下游加工工艺的优化红曲色素分为水溶性和醇溶性两种，发酵完毕后水溶性红曲色素为胞外色素，占总发酵色素的20%左右，菌丝体内的为醇溶性色素，水溶性色素需要经过板框压滤和离心收集滤液，醇溶性需要用70%80%的乙醇进行多次抽提，提取完毕后将两种滤液混合，对酒精进行回收，然后进行喷雾干燥，最后得到干燥粉末状的红曲色素。（5）物料衡算结果红曲色素液体发酵的发酵周期为4d，一年的发酵次数为33次，年产3万吨红曲色素共需要400m3的发酵罐38个，每个罐的大米粉用量：8057kg；豆饼粉用量：1791kg；NaNO3 用量：179kg；MgS04用量：179kg；KH2P04用量：89.53kg。发酵罐内的高径比为1.74，发酵罐筒身高为14.1m；搅拌器直径为1.88m;发酵罐内径为5.64。本设计通过一系列诱变选育出高产菌株、优化培养基、把握关键控制点、优化下游加工过程，使在红曲色素的效价提高的同时，降低生产成本。势必加快红曲色素在更多领域的应用。参 考 文 献1 高红. 试论红曲在我国传统食品和食疗保健中的作用四川食品与发酵. 1997, (3): 6102 雷萍, 金宗濂. 红曲中生物活性物质的研究进展. 食品工业科技, 2004, 24(9): 86873 葛继志, 张颖. 红曲霉变异株产色素发酵条件研究. 生物学杂志, 1999, (5): 35374赵欣树, 沈昌. 红曲色素形成机制及提高其色价的途径. 食品科 学, 2005, 26(7): 256257 5 陈国珍, 石鹤, 占玉珍等. 红曲霉液体发酵和红色素提取的研究. 调味副食品科技. 1982, (3): 17196 郑丹. 红曲霉产色素及Monacolin K的固体发酵工艺研究. 西安: 陕西科技大学, 20067 陈义光, 彭得娇, 田宏观. 红曲及红曲霉的研究应用. 湖北农学院学报, 2000, 20(2): 1881908 姚继承, 赵秀举. 红曲色素产业现状. 中国食品报, 2007, 11: 679 朱文锦. 红曲霉产色素及Monacolin K的固体发酵工艺研究. 西安: 陕西科技大学, 200610 黄前美, 朱明军, 吴振强. 红曲霉液态发酵产红曲色素研究进展. 安徽农业科学, 2011, 39(1) : 241243, 24611 刘玺, 周卫兵, 高孔荣. 红曲色素高产菌株发酵特性的研究. 1996, 17(3): 6912 赖建平, 罗军. 红曲色素生产菌的诱变筛选与培养. 广州大学报综合版. 2000, 14(3): 434713 梁智嫦. 高色价高稳定性红曲霉菌种的选育. 食品科技. 2000, (5): 353714 印红. 空间飞行对红曲霉菌产量的影响. 航天医学与医学程. 2003, (10), 37537815 单成双. 从日本专利所见的食用天然色素. 食品科学, 1983, (7): 34 3816 Martinkova. Biological activity of polyketide pigmentsproduced by the fungus Monascus. Applied Bacteriology, 1995, 79: 60961617 Yongsmith B, W Tabloka, W Yongmanitchai, et al. Culture conditions for yellow pigment formation by Monascus spKB 10 grown on cassava medium. World J Microbiol Biotechno, 1993, 19: 8590 18 MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem, 1959, 31( 3): 426428 19 Sonia Campoy, Angel Rumbero, Juan F, et al. Charac -terization of an hyper - pigmenting mutant of Monascus purpureus IB1: identification of two novel pigment chemical structures. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 70: 48849620 陈家文. 水溶性红曲色素工业性试验研究. 食品与发酵工业, 2000, 26(2): 202421 梁智嫦. 高色价高稳定性红曲霉菌种的选育. 食品科技, 2000, (5): 353722 赖建军, 罗军. 红曲色素生产菌的诱变筛选及培养. 广州大学学报, 2000, 14(3): 465023 张伟平. 复合诱变红曲霉选育红色素高产菌株. 湖北二学院学报, 2003, (8): 5 724 童群义. 液态深层发酵生产红曲色素的最佳培养条件. 湖南农业大学学报. 1998, 6: 22623025 郭红珍, 王秋芬, 马立芝. 液态发酵产红曲色素的研究. 食品工业科技, 2008, 29(3): 15415626 彭中健, 梁淑娃, 陈郧东等. 红曲霉深层发酵生产红曲色素的研究. 四川食品与发 酵, 2004, 40(122): 283127 童群义, 高孔荣. 红曲色素的提取工艺的研究. 食品工业科技, 1998(2): 272928 夏明, 杜琪珍. 溶剂与pH对红曲色素提取效率的影响. 食品研究与开发, 2003, 24(6): 12512629 宫会会, 陈惠阴. 红曲与红曲色素的研究进展. 武汉工业大学学报, 2002, (1): 22 2430 童群义, 高孔荣. 红曲色素的提取工艺研究. 食品工业科技, 1998, (2): 272279致谢在论文完成之际，我首先向关心帮助和指导我的指导老师崔丽霞表示衷心的感谢并致以崇高的敬意！ 在学校的学习生活即将结束，回顾四年来的学习经历，面对现在的收获，我感到无限欣慰。为此，我向热心帮助过我的所有老师和同学表示由衷的感谢！在论文工作中，遇到了许许多多这样那样的问题，有的是专业上的问题，有的是论文格式上的问题，一直得到 崔丽霞老师的亲切关怀和悉心指导，使我的论文可以又快又好的完成， 值此论文完成之际，谨向崔丽霞老师致以最崇高的谢意！ 最后，衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授！第 24 页 共 25 页