09年广东省大学生生化技能大赛作品展

09年广东省大学生生化技能大赛作品展（1）广东省生物化学实验技能大赛编号:57实验名称：橙皮苷的提取与鉴定学院电子科技大学中山学院系别化学与生物系参赛者联系方式杨映辉15820533716翁妮曼15019913441完成日期2009年6月14日感谢:主办单位共青团广东省委员会广东省教育厅广东省科学技术厅广东省学生联合会承办单位共青团华南农业大学委员会华南农业大学生命科学学院华南农业大学教务处活动策划华南农业大学生命科学学院团委及学生会摘要：方法：本实验以晒干的柑橘皮为原材料，利用橙皮苷在碱性条件下开环溶解进行提取，酸性条件下闭环沉淀进行分离,采用碱浸酸提法,用95的甲醇和氢氧化纳溶液作为浸提液,在90C保温浸提2h,以及用盐酸调节PH,静置1h等方法，干燥后得到粉末状物质。结果：利用其乙醇溶液与三氯化铁试剂反应后，呈暗褐色,可鉴定所提取物质中含有橙皮苷（橙皮苷中含有酚羟基，可与三氯化铁试剂发生显色反应）。再用紫外分光光度计测其溶液的吸光度，与橙皮苷对照品溶液所测出的吸光度标准曲线作对比，可知所得样品的浓度。结论：提取物的乙醇溶液与可与三氯化铁试剂发生显色反应，呈暗褐色。通过紫外分光光度计测得提取物溶液的吸光度为0.111,则其浓度为123.33g/ml。关键词：橙皮苷提取鉴定1前言：1.1背景资料橙皮苷(甙)（Hesperidins：Vitamin P），是一种广泛存在于柑橘类水果中的类黄酮物质，其化学结构为具有双氢黄酮氧苷结构，呈弱酸性，提取得到的粗产物为淡黄色粉末。纯品为白色粉末，无色细树枝状针形结晶（PH6-7沉淀所得），略带苦味，难溶于水，熔点258-262(250软化），几乎不溶于乙醚、丙酮、苯、氯仿，微溶于乙醇、甲醇，稍易溶于热醋酸、苯胺，可溶于甲酰胺、二甲酰胺、吡啶、甘油、稀碱溶液。其乙醇溶液中滴加三氯化铁试液后，呈暗褐色。用镁粉和盐酸还原后，呈紫红色。溶解于碱液，呈黄色。加酸至一定pH值，又沉淀析出。在稀酸中水解，生成橙皮素、鼠素糖和葡萄糖。纯度为97%的橙皮苷熔点范围为257260，分子量为610.6，分 子 式：C28H34O15，比旋光度=-76(2吡啶溶液)。图二氢黄酮甙;Hesperidin的结构式图2橙皮苷结构式橙皮苷大部分存在于柑桔加工的废弃物中，如果皮、果囊中，其中成熟的果皮和组织中橙皮苷的含量最高（内果皮30%-50%，桔络、核、果肉中30%-50%，外果皮10%-20%），汁液和桔囊中含量较低1%-5%。橙皮苷结晶大多存在于薄壁细胞中，黄色或无色，呈圆形或无定形团块，有的可见放射状条纹。螺纹、孔纹和网纹导管及管胞较小。1.2前人研究成果及可行性与创新性1.2.1前人研究成果橙皮苷的提取方法有溶剂萃取法、碱提酸沉法、碳粉吸附法、离子交换法1-4、索氏提取法、超声提取法、加热回流提取法5，其中索氏提取法较繁琐，碱提酸沉法操作简单、成本低，提取率较高。1.2.2方案的可行性橙皮苷的提取主要是利用其所含的两个酚羟基在碱性条件下，与溶液中的钠离子反应生成钠盐而溶出，然后酸化、冷却，使其从溶液中析出。从柑橘果皮中提取橙皮苷一般采用热提取法和浸泡提取法，收率均不理想。近年来，超声提取天然植物(特别是中草药)中的有效成分研究已广泛开展，且取得一定的进展。利用橙皮苷在碱性条件下开环溶解进行提取，酸性条件下闭环沉淀进行分离，提取时加大碱用量，可减少乙醇用量，但碱性不宜过大，否则，橙皮苷易被氧化破坏。1.2.3我们的创新点文献6用95%的乙醇作为浸提液,调节PH为3-5左右,我们发现,没有加入碱液提取的效果不明显,于是,我们加入了W=30%的NaOH溶液,调节PH为11,效果明显。利用Al(NO3)3溶液与橙皮苷反应生成络合物时,我们发现,如果采用文献7的方法,在80水浴15min,再用蒸馏水定容,溶液的吸光度会降低,所以,我们将实验方法改为静置10min，使其完全反应,然后再定容,结果得到较高的吸光度。2实验目的研究橙皮苷的提取方法以及对橙皮苷进行鉴定。实验原理3.1柑橘属中的类黄酮含量丰富,易于分离，橙皮苷是柑橘属中含量丰富的一种类黄酮。3.根据前人实验6，我们比赛前做了多次试验，证明甲醇含量、酸碱度对橙皮苷的提取率均有影响，具体数据如下：表一甲醇含量对橙皮苷提取率的影响项目数值甲醇含量/%959080706050橙皮苷收率/%0.350.310.260.190.08几乎没有表二PH对橙皮苷收率的影响项目数值PH值203040506070橙皮苷收率/%021402560274029202300198又发现,将柑橘皮置于浸体液中静置过夜，能达到较高的收率。于是，我们用95%的甲醇和氢氧化纳溶液作为浸提液,值控制在11左右，在90C保温浸提2h。3.3甲醇的沸点为64.5C,在70C的恒温干燥箱内被蒸发。3.4利用硝酸铝体系与橙皮苷形成络合物的原理，采用分光光度法测定橙皮苷含量。橙皮苷和Al(NO3)3水溶液反应后生成的络合物在422nm处有最大吸收,在0-100g/mL的浓度范围内吸光度具有良好的线性关系。因此，可根据标准曲线估计所提取橙皮苷溶液的浓度。3.5橙皮苷中含有酚羟基，其乙醇溶液与可与三氯化铁试剂发生显色反应，橙呈暗褐色。4课题的提出考虑到全世界有80多个国家栽培柑桔，其产量居所有水果之首，而中国又是世界上主要的柑桔生产国之一，产量居世界第三。柑桔鲜食和加工下脚料的桔皮数量约占柑桔产量的20%，除了水分、纤维素、木质素外，还含有丰富的香精油、色素、果胶、橙皮苷等，是一种可以更新的生物资源，在中国大部分未得到利用而被废弃，造成很大的浪费，而且带来了环境污染问题。如果将这一资源加以综合利用，就会变废为宝，大大提高柑桔产业的经济效益。而且，橙皮苷具有维持血管正常渗透压，增强毛细血管韧性，缩短出血时间，降低胆固醇等作用，是高血压和动脉硬化所致的血管疾病有效的治疗剂和预防剂。在食品工业中可用作天然抗氧化剂。此外由橙皮苷制取得甲基橙皮苷可制成药用化妆品、营养化妆品及治疗黑斑、雀斑等皮肤的药物。因此，提取橙皮苷具有巨大的价值及经济效益。实验材料及试剂表三实验材料实验材料规格备注橙皮苷对照品HPLC98%20mg维克奇生物科技有限公司干柑橘皮30g表四实验所需试剂试剂规格用量甲醇95%500mlNaOH溶液W=30%250ml稀盐酸C=0.02mol/L500ml浓盐酸W=38%10ml蒸馏水2LAl(NO3)3溶液W=5%50mLFeCl3溶液0.1mol/L50ml无水乙醇100ml若干试剂的配制：试剂1W=30%的NaOH溶液:精密称取75g氢氧化钠固体于500ml的烧杯中,加蒸馏水溶解,再将其移到250ml的容量瓶中定容到刻度。w=mV=75g/250ml=0.3g/ml=300g/L=30%-式1试剂2 C=0.02mol/L的稀盐酸：精密称取0.83ml12mol/L浓盐酸于100ml的烧杯中,加蒸馏水溶解,再将其移到500ml的容量瓶中定容到刻度。C(稀HCl)= V(浓HCl)C(浓HCl)V=0.833ml12mol/L500ml=0.02mol/L-式2试剂3 w=5%Al(NO3)3溶液：精密称取0.25克的硝酸铝晶体,置于100ml的烧杯中,加蒸馏水溶解,再将其移到50ml的容量瓶中定容到刻度。W=mV=25g500ml=50g/L=5%-式3试剂4 0.1mol/L的FeCl3溶液：精密称取0.8125克的FeCl3固体,置于100ml的烧杯中,加蒸馏水溶解,再将其移到50ml的容量瓶中定容到刻度。C=nV=mMV=0.8125g162.5g/mol50ml=0.0001mol/ml=0.1mol/L-式46实验仪器表五实验所需仪器仪器规格数量玻璃棒2根电子天平1台称量纸若干抽滤装置(包括滤纸)2个烧杯50ml1个烧杯100ml2个烧杯500ml2个烧杯1000ml2个铁架台2个恒温水浴锅HHS型1台PH试纸1包温度计100C1根冷凝管(回流装置)2个圆底烧瓶250ml2个旋转蒸发仪+真空泵1台恒温干燥箱60C 100C(最高可200C)1台表面皿2个紫外可见分光光度计751型1台容量瓶10ml7个容量瓶50ml2个移液管1ml2支洗尔球2个吹风筒1个胶头滴管2支7实验步骤7.1提取过程干桔皮粉碎预处理静置过夜保温浸提冷却过滤滤液旋转蒸发调节ph值静置沉淀过滤干燥产品7.1.1粉碎:将干燥的柑橘皮粉碎至直径约4-5mm的碎块，称取30g。7.1.2预处理：加入0.02mol/L的稀盐酸，在室温下搅拌30min，重复用该稀盐酸洗涤2次，再用流水洗涤至中性。置于20倍量的去离子水（600ml）中，用盐酸调节pH为2，在90下搅拌提取1 h，然后冷却过滤。7.1.3静置过夜：将W=95%（体积分数）的甲醇（240ml）和W=30%的NaOH溶液混合。将滤渣置于混合液中，平均放入两个250mL的圆底烧瓶中，调节PH=11，静置过夜。7.1.4保温浸提：将圆底烧瓶安装上回流装置，在90C的恒温水浴锅中浸提2h。7.1.5冷却过滤：冷却后，用抽滤装置对浸提后的物质进行抽滤,收集滤液。7.1.6旋转蒸发：用旋转蒸发仪对滤液进行旋转蒸发，控制温度在80,20min后得到浓缩液。7.1.7调节ph值：将浓缩液调节PH到4。7.1.8离心过滤:将调节PH到4的浓缩液装入离心试管，进行离心过滤7.1.9干燥：用恒温干燥机对所得物质进行烘干，控制温度在70C左右。7.2产品分析鉴定7.2.1对照品溶液的制备精密称取橙皮苷对照品10mg，溶于100ml烧杯中,用95%的甲醇溶解并移入25ml容量瓶中，摇匀，作为对照品储备液C=408g/mol；精密吸取对照品储备液2ml、3ml、4ml、5ml、6ml到编号为2-6的10ml容量瓶中，再分别加入1ml的W=5%的硝酸铝溶液7，摇匀，静置10min，使其完全反应。同时，在编号为1的容量瓶中加入1ml的W=5%的硝酸铝溶液。然后，加入蒸馏水定容至刻度。7.2.2测定吸光度从编号为1-6的容量瓶中分别取1ml的溶液于比色皿中，用紫外分光光度计分别测其吸光度，记录数据，绘制标准曲线。7.2.3测定待测品溶液的浓度取所得粉末1mg于烧杯中，用95%的甲醇溶解，移至10ml容量瓶中，再加入1ml的硝酸铝溶液，摇匀，待其反应10min，用蒸馏水定容。取1ml于比色皿中，测其吸光度，将之与标准曲线对照，得出所提取橙皮苷在此溶液中的浓度。（橙皮苷在流动相中的最大吸收波长为422nm。）C1=m/V=1000g/10ml=100g/ml-式57.2.4化学方法鉴定取所得粉末0.5 mg于烧杯中，用50ml的无水乙醇溶解,滴加0.1mol/l的FeCl3溶液,观察显色。8实验技巧8.1实验开始时,先打开恒温水浴锅,调节温度到90C,让其加热，可节约实验时间。8.2静置过夜时，应将圆底烧瓶密封，防止甲醇挥发。8.3产品烘干时,可先打开紫外分光光度计,让其预热20min。9实验结果表六不同浓度的橙皮苷溶液与Al(NO3)3溶液反应后溶液的吸光度组号1234567C（g/ml）080120160200240对照品储备液(ml)023456待测品溶液Al(NO3)溶液(ml)1111111蒸馏水定容(ml)10101010101010吸光度/A0.0000.0540.0920.1370.1630.232标准曲线的绘制：图不同浓度的橙皮苷溶液与Al(NO3)3溶液反应后溶液的吸光度浓度绘制标准曲线，其回归方程为：A=0.0009CR=0.9687待测品溶液的吸光度为：0.111则其浓度C为：123.33g/ml八、讨论通过赛前试验，我们得出了较好的操作方法，加上熟练的实验技能，使我们在一定的时间内完成了这个比较复杂的实验，并且得到了合格的成品。我们所测出的吸光度符合线性规律，所配制的溶液浓度适宜，达到较好的吸光度。九 实验时间安排表七实验时间安排项目时间安排预实验阶段(13日)材料的准备(预先做好，不占用正式实验时间)粉碎约5min(预先做好，不占用正式实验时间)预处理约2h(预先做好，不占用正式实验时间)静置过夜正式实验(14日)保温浸提2h冷却过滤约30min旋转蒸发约20min调节ph值约1min静置30min离心过滤约20min干燥约10min化学方法鉴定约2min紫外光谱鉴定约1h论文写作约1h，事先准备好大部分素材十注意事项10.1实验过程中注意安全操作。10.2实验时控制好时间，注意规范操作，避免仪器的损坏和试剂的浪费。10.3控制甲醇含量，防止果胶沉淀，影响橙皮苷的提取。十一实验总结本次实验，我们成功地提取了橙皮苷，并得到了很好的收率，为他日进行更高层次的实验奠定了基础。在实验过程中，我们团结互助，默契配合，遇到问题努力解决，顺利并且独立地完成实验。参考文献1邵伟，熊泽等，橙皮苷的光谱测定，光谱实验室，2005.22(5)：104410462汤青云，雷存喜等，柑橘皮中橘皮油、果胶、橙皮苷的提取和利用，湖南城市学院报，2003.24(6)：1031043臧玉红，柑橘皮的综合利用，食品工业和发酵工业，2005.31(7)：1451464梁开玉，罗启波等，从陈皮中提取橙皮苷工艺研究，重庆工商大学学报，2004.21(1):19225中国药典，国家药典编委会，2005年版（一部），北京:化学工业出版社，2005，132，315，5676贾长英，李卫华，陈新等，新橙皮苷的提取及鉴定，精细石油化工进展，2007.77赵虹桥，文赤夫，湘西椪柑果皮中橙皮苷的提取与纯化，现代食品科技，2008，Vol24，NO.8:812-815实验感言通过参加本次生物与化学实验技能大赛，极大地提高了我们的实验动手能力并增强我们的团队合作精神。感谢华南农业大学给我们提供一次如此宝贵的机会，让我们与广东省各高校的化生精英们一起同台竞技，进行学术交流，感谢华南农业大学生命科学学院提供足够的设备，让我们顺利完成本次实验，也感谢我们学校实验室的老师,给我们提供各种帮助。