面包酵母的诱变选育、培养基优化及发酵过程

河北师范大学 发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程 2010年12月25日 面包酵母的诱变选育、培养基优化及发酵过程 姓 名：孙晓晴 学 号：2008011107年 级：2008级 专 业：生物技术 指导教师：边艳青 2010-12-25面包酵母的诱变选育、培养基优化及发酵过程孙晓晴 2008011107（河北师范大学生命科学学院生物技术专业 石家庄 050000）【摘 要】 发酵工程是生物技术的五大技术之一,是生物技术的重要组成部分,是生物技术产业化的重要环节,它是微生物学、生物化学和化学工程学有机的结合的后续课程,发酵工程实验是配合发酵工程教学开设的一门课程。根据课程特点,本学期发酵工程实验内容为模拟整个发酵过程,从菌种选育开始,经过培养基的优化,发酵过程控制,最终确定面包酵母突变株的最适生长培养基、生长规律、pH变化规律以及溶氧规律等。【关键词】 面包酵母;诱变育种;培养基优化;发酵酵母生产是发酵工业的一个重要组成部分,目前世界酵母年产量约200万吨,主要应用于食品工业,面包酵母是其中最典型的一种。酵母菌通常形成球形或椭圆形,对制作面包而言椭圆形的品种为最佳,俗称真酵母菌。面包酵母是在制备焙烤产品时常用的一种添加剂,它利用面粉中可发酵性糖产生的CO2膨胀面团的体积,通过面团体积的膨胀来改良面团的组织结构并改善面包的风味。因此,选育优良的面包酵母菌种有着巨大的社会经济效益。我国在面包生产中存在的问题之一是生产周期长（一般为8-12小时）,生产效率低,与国外先进的生产方法相比,有较大差距。本实验在改良面包酵母菌种的基础上,对培养基进行优化,对发酵过程进行全面合理控制,从而进一步完善面包酵母的发酵工艺。1. 材料1.1 菌种面包酵母（来自边老师提供）1.2 培养基1.2.1 PAD培养基马铃薯（去皮）200g,切成小块, 加 1000mL水,煮沸1h,用双层纱布滤,取出滤液,加葡萄糖20g使其完全溶解,加水定容到1L,pH自然。若为固体培养基,则加琼脂20g/L。1.2.2 发酵培养基 经过2.2优化步骤选出的最优培养基配方,在文章中会介绍到。1.3 试剂琼脂;葡萄糖;酵母膏;蛋白胨;(NH4)2SO4;自来水1.4 器材及用具 分析天平、普通光学显微镜、高压灭菌锅、震荡培养箱、恒温培养箱、培养皿、超净工作台、发酵罐、蒸汽发生器、空气压缩机等;锥形瓶、枪头（蓝、黄）、移液器、涂布棒、试管、血细胞计数板、计数器、酒精灯等。1.5 发酵罐发酵罐的结构包括罐体、挡板、搅拌、空气分布系统、热交换系统、蒸汽系统等。不同的系统作用不同,且为稳定发酵条件起到重要的作用。2. 试验方法本实验以小组为单位自行设计实验流程。2.1 诱变选育菌种采用物理因子紫外线诱变面包酵母,DNA能够强烈吸收紫外线,尤其是碱基中的胸腺嘧啶,从而形成二聚体,改变DNA结构,引起基因突变。再筛选有利突变菌株进行培养。常用的是15瓦的低功率紫外灯,其波长集中在253.7nm,距离常用34cm,时间几十秒到几分钟不等。2.1.1培养基配制及无菌物品准备 配制PAD固体培养基、液体培养基,准备培养皿、试管、9ml无菌水试管、涂布棒、枪头等包好,置于高压灭菌锅中,121,20min 灭菌。打开超净工作台紫外灭菌30min。2.1.2 制备菌悬液 在超净内,取1ml菌悬液加入盛有9ml无菌水的试管中,计数。顺序依次进行10-110-8稀释。2.1.3 涂布法接种 选取上述稀释好的浓度为10-6和10-7的菌悬液,各吸取0.5ml涂布在固体平板培养基上,每个稀释度涂15板,保证每个固体平板培养后菌落数在3080个,以便菌落计数和菌落形态观察。做好标记。2.1.4 紫外诱变 本实验设计了0s、30s、60s、90s、12s五个诱变剂量,将上述培养基分组置于超净工作台内,每个稀释度作3个平行。由于紫外线的穿透能力很差,因此要打开平皿盖,按照五个诱变剂量进行紫外照射诱变。标记。在培养箱中28倒置培养12天。 诱变时间稀释度0s30s60s90s120s10-612310-71232.1.5 突变菌株的筛选 将培养好的培养皿进行菌落计数和形态观察,找出菌落生长状态最好的平板,记下稀释度和诱变剂量。在无菌条件下挑单菌落,接液体培养基,28震荡培养3天,挑选生长好的菌液,4冰箱保存,备用。2.2 正交试验设计优化培养基 正交试验设计（Orthogonal experimental design）是研究多因素多水平的设计方法,它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验,这些有代表性的点具备了“均匀分散,齐整可比”的特点,是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。本实验设计四因素三水平即L9(34)来筛选最优培养基配方。2.2.1 根据问题和实际要求确定影响因子及影响因子水平,列出因子水平表。影响因子影响水平酵母膏蛋白胨葡萄糖pH10.5%0.5%2.0%521.5%1.5%4.0%633.0%3.0%6.0%72.2.2 根据因子水平表设计正交表。No.酵母膏蛋白胨葡萄糖pH111112122231333421235223162312731328321393321对照1%1%2%6.4 2.2.3 根据正交实验设计表进行试验。2.2.3.1 培养基配制及无菌物品准备配方基础为：酵母膏(1%);蛋白胨(1%);(NH4)2SO4(0.5%);葡萄糖(2%);pH=6.4。将上述基础药品配制成10倍母液,每种培养基配30ml,按比例加入母液。最后调pH。另按配方基础配一组培养基作为对照组。将培养基和所需用具包好,进行湿热灭菌,121,20min。2.2.3.2 接种待培养基冷却至60左右时,无菌条件下,每管培养基接种1ml菌悬液。28摇培17h。2.2.3.3 计数及级差分析将上述培养好的10种培养基的菌液稀释到合适浓度后进行计数和级差分析,筛选出最适面包酵母生长的培养基配方,作为优化培养基,用以进行发酵。2.3 分批发酵2.3.1 熟识发酵罐结构 2.3.2 发酵前准备 按照最优培养基配方配制培养基：酵母膏20g、蛋白胨10g、葡萄糖40g、(NH4)2SO4 5g、pH=6.4。把配好的培养基倒入发酵罐中定容至12 L。2.3.3 分批灭菌2.3.3.1 盖好罐盖,对成拧紧螺丝,温度控制改为手动控制;2.3.3.2 开排气阀门402,开阀门403排夹套冷却水,关闭其他阀门;2.3.3.3 开启搅拌;2.3.3.4 开蒸汽阀门202,夹套进汽,待排水出口有蒸汽排出时,关小阀门403,进行培养基预热;2.3.3.5 当培养基温度达到98时,停搅拌,开蒸汽阀门201,微开阀门401,关小阀门402;2.3.3.6 调节蒸汽阀门201、202,使罐温稳定在120124。开始计时;2.3.3.7 取样阀灭菌,开蒸汽阀门203,半开阀门405,缓慢旋开取样阀;2.3.3.8 旋松接种口盖,有少量蒸汽冒出即可。灭菌维持2030min;2.3.3.9 灭菌结束。旋紧取样阀门,关闭阀门405、203,开402、关闭401;2.3.3.10 关闭蒸汽阀门202、403;2.3.3.11 关闭201,当罐压接近0.05Mpa时,开空气流量计针阀,开阀门102,空气进入罐内,调节排气阀门402,控制罐压;2.3.3.12 开进水阀门302、404,该温度控制为自动控制,开始冷却。冷却到设定温度,备用。2.3.4 发酵罐接种接种前,用75%酒精棉球对接种口消毒,然后火焰环放置在接种口处,按10%接种量将种子液迅速倒入发酵罐内。2.3.5 发酵过程监控 在发酵过程中,每隔30min,记录发酵液的pH值和溶氧(Do)值,并每隔1h用试管在取样口处取样,对菌液进行计数。2.3.6 结束发酵 停止发酵后,对发酵液和冷却水进行放罐,仔细清洗发酵罐和电极,重新安装备用。3. 结果与讨论3.1 诱变育种结果由下表可以看出,经过诱变后,酵母菌的死亡率非常高,部分平板的结果甚至是100%。可能是由于计数时出现失误,经稀释后菌的浓度过低,大剂量的诱变对菌体伤害作用很大,导致死亡。只有在10-6浓度、30s诱变剂量下出现了符合要求的突变菌株。诱变时间稀释度0s30s60s90s120s10-614621102390010317000010-7119110021310003170000死亡率（%）097.798.998.91003.2 正交试验设计优化培养基结果3.2.1 正交结果（级差分析法）级差R的大小代表影响因素对菌体生长的影响水平大小,级差越大,说明该因素对菌体繁殖的影响越大,即为主要影响因素。根据级差R的大小确定主次因素的次序,可知四因子对菌体生长繁殖的影响程度依次为酵母膏蛋白胨pH葡萄糖。据K值的大小确定最适宜的配比,最大的K值对应最好的水平。对照组最终的菌液浓度为6.87108个/ml，3、4、6、7、8、9组的菌液浓度均大于对照组。因此,本组的最适培养基配方组成为：酵母膏3%、蛋白胨3%、葡萄糖4%、pH=5（如下表所示）。No.酵母膏蛋白胨葡萄糖pH菌液浓度（108 个/ml）111114212226.57313337.5421238522316.25623128.75731328832138.29332112K16.086.676.986.75K27.676.617.777.77K399.427.257.9级差R2.982.750.781.153.2.2 各影响因子的影响趋势3.2.2.1 酵母膏根据K值的变化趋势，可以看出酵母膏含量越大，k值越大，即菌体生长越旺盛。且K值有继续增大的趋势，说明还可以增大培养基中酵母膏的含量。3.2.2.2 蛋白胨由K值的变化趋势可以看出，蛋白胨含量在0.5%1.5%范围内时，菌体繁殖速率缓慢；在1.5%3%范围内，随着蛋白胨含量的增加，菌的生长水平也越来也好。按照该趋势，还可以继续增加蛋白胨的含量。3.2.2.3 葡萄糖根据K值大变化趋势可以看出，葡萄糖含量在2%4%范围内，随着葡萄糖含量的增多，酵母菌生长越旺盛；而在4%6%范围内，酵母菌的生长速度则随着葡萄糖含量的增多而下降。说明4%是葡萄糖的最好水平。3.2.2.4 pH由图可以看出，K值随着pH的增大而逐渐增大，在67范围内趋势变缓。即酵母菌的生长随pH的增大而越来越旺盛。该结果与实际酵母菌在其生长最适pH范围的生长趋势不符，可能是由于培养基中糖含量高造成的。3.3 分批发酵结果周期菌数(个/ml)pHDo(%)0h4.8251066.091000.5h5.51066.0183.31.0h5.9479.41.5h7.41065.8779.42.0h5.8078.12.5h1.271075.7077.03.0h5.5972.03.5h1.931075.4465.03.3.1 发酵过程中生长曲线由图可以看出，随着发酵时间的增长，酵母菌的繁殖速度越来越快，从延迟期阶段过渡到对数生长期初期阶段。由于营养物质丰富，细胞生长不受限制，细胞浓度呈指数增长，比生长速率会在对数期中期达到最大值。3.3.2 pH曲线由图可以看出，随着发酵时间的增长，发酵液的pH值逐渐变小。排除杂菌污染的可能，主要是由酵母菌生长代谢和培养基成分的改变引起的。3.3.3 溶氧变化规律由图可以看出，随着发酵时间的增长，发酵液的溶氧量降低速度先是很快，然后缓慢，之后又加快。菌体浓度直接影响发酵液的溶氧量，因此，随着菌体的浓度的增大，溶氧量逐渐降低。且菌体的自身代谢对溶氧量也有很大的影响。4. 实验中存在的问题及改进措施整个实验分三次完成,流畅性很好,总的来说是比较成功的。但由于时间等客观条件限制的原因,实验中出现了一些问题。主要问题及改进措施如下：4.1 紫外诱变育种过程 死亡率过高 由于初始菌悬液浓度计算失误,使得涂布接种到培养基上的菌数过少,再经紫外照射,导致部分平板上无菌落生长,即菌的死亡率为100%。改进 为了降低诱变后的死亡率,可以改为先按诱变剂量诱变初始菌悬液,之后再计数,进行梯度稀释,再涂布接种,可以提高存活率。4.2 培养基优化过程影响因子的梯度范围相差不大,不能全面反映影响程度的总体趋势。且只进行了这一次实验,存在较大误差。改进 设计影响因子的范围梯度时,应先设计较宽范围,得出大体影响程度趋势,再一步一步进行细化,逐步得到最优水平的培养基配方。还应设计23个平行,以减小实验误差。4.3 发酵过程由于受到时间的限制,实验并没有涉及到发酵的全过程,菌体的生长只度过了延迟期,进行到了对数期的初期,不能得到酵母菌的完整的生长曲线,实验的完整性不好。改进 合理利用课余时间,安排学生参观发酵设备和体验发酵过程,使同学们能接触到发酵的每一个时期,了解整个发酵周期的调控,加深对发酵技术的理解。5. 研究展望发酵工程是一门具有悠久历史,又融合了现代科学的技术,是现代生物技术的组成部分。现代的发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产,还包括微生物机能的利用,其主要内容为生产菌种的选育,发酵条件的优化与控制,反应器的设计及产物的分离、提取与精制等。工业生产上常用的微生物包括细菌、放线菌、霉菌和酵母等。在目前能源、资源紧张,人口、粮食及污染问题日益严重的情况下,发酵工程作为现代生物技术的重要组成部分之一,得到越来越广泛的应用,而其中酵母菌的发酵技术更是迅猛发展,有着广阔的发展前景。参考文献1边艳青.发酵工程实验指导.河北师范大学生命科学学院,2008.2姜天笑,肖冬光,刘青,胡娅兰.快速发酵面包酵母菌株的选育.食品研究与开发,2006.3曹军卫,马辉文,张甲耀.微生物工程(第二版).科学出版社.4刘如林1995微生物工程概论.天津：南开大学出版社.5束强民,陈孝民,颜方贵.面包酵母菌种改良的研究进展.食品与发酵工业.1996.6百度百科,百度文库,谷歌搜索.第 12 页 共 11页