沉淀反应Precipita

沉淀反应（Precipitation)概念n可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反应。 反应分两个阶段： 第一阶段发生抗原抗体特异性结合 速率法 第二阶段形成可见的免疫复合物 终点法类型（一）环状试验（ring test) 将已知的抗血清放入小口径玻璃管内，小心加入适当稀释的抗原溶液于抗血清表面，使两溶液成为界面清晰的两层，数分钟后界面处出现白色沉淀环即为阳性。用于血迹鉴定等。（二）絮状沉淀试验 （flocculation precipitation test) 抗原与相应抗体在试管内结合后，凝聚成为絮状或颗粒状的不溶性沉淀物，即为阳性反应。（三）琼脂扩散试验 （agar diffusion test) 含水分的半固体琼脂凝胶如网状支架，允许可溶性抗原与抗体在其网间扩散，在适量电解质存在下，抗原与抗体在两者相遇的最适比例处形成可见的白色沉淀线。1.双向扩散（double diffusion) 抗原和抗体在琼脂内各自向对方扩散。（1）抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估计；（2）抗原或抗体相对分子量的分析；（3）用于抗原性质的分析；（4）用于抗体效价的滴定。AgAbA B C D E F A: A: 浓度浓度AgAg、AbAb及扩散率近似；及扩散率近似； B B：浓度：浓度AgAg、AbAb近似，扩散率近似，扩散率AgAgAb Ab ； C C：浓度：浓度AgAg、AbAb近似，扩散率近似，扩散率AgAgAb Ab ； D D：浓度：浓度AgAgAbAb，扩散率近似；，扩散率近似； E E：浓度：浓度AgAgAbAb，扩散率，扩散率AgAgAb Ab ； F F：浓度：浓度AgAgAbAb，扩散率，扩散率AgAgAb Ab ；2 2表示标准表示标准AgAg1 1表示待检表示待检AgAg待检待检AgAg与标准抗原完全吻合；与标准抗原完全吻合；待检待检AgAg中含有与标准中含有与标准AgAg相同的相同的AgAg；还有另外的；还有另外的AgAg与与AbAb相对应；相对应；待检待检AgAg有与有与AbAb相对应的相对应的AgAg，但，但与标准与标准AgAg不同；不同；待检待检AgAg与标准与标准AgAg性质相同；但性质相同；但含量较低；含量较低； 1.1.周围周围6 6个孔放不同稀释度的相应个孔放不同稀释度的相应AbAb。 2.2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。该抗体的效价。 3.3.可进行任意稀释。可进行任意稀释。 “1” “1” 为单一抗原抗体系统。为单一抗原抗体系统。 “n” “n” 为多个抗原抗体系统。为多个抗原抗体系统。 * *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 * *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。可以用混合抗体鉴定抗原纯度。2.单向扩散（single diffusion) 在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。 沉淀环的直径与抗原浓度成正比。 定量试验，用于测定标本中IgG、IgM、IgA。（沉淀环直径（沉淀环直径) )2 2抗原浓度抗原浓度1.1.抗体混于凝胶中抗体混于凝胶中2.2.抗原加入孔内抗原加入孔内3.3.抗原自由扩散抗原自由扩散标准品抗原浓度测定标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定1.1.测定沉淀环直径测定沉淀环直径2.2.在标准曲线上查找在标准曲线上查找 相应抗原浓度相应抗原浓度3.对流免疫电泳 （counter immunoelectrophoresis) 双扩+电泳技术 Ag靠阴极，Ab靠阳极侧 pH8.6巴比妥缓冲液Ag等电点为pH4-5,带负电多，Mr较Ab小，电泳速度快，向正极泳动。Ab等电点pH6-7，带负电少，Mr较大，抵不过电渗力，向负极泳动。对流免疫电泳图-+AgAb4.火箭电泳 (rocket electrophoresis) 单扩+电泳技术5.免疫电泳(immuno_electrophrosis) 双扩+区带电泳 分辨力及特异性高,用于纯化抗原及抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别。火箭电泳图免疫电泳图-+-n经典的沉淀试验四大缺点:n操作繁琐 n敏感度低(10100ug/ml)n时间长n难以自动化（四）免疫浊度法（immunonephelomtry) 利用抗原-抗体复合物在液相中形成的浊度来测定抗原的含量。 现代光学测量仪+自动分析检测系统 方法快速、敏感性高、稳定性好、微量、可自动化。1.透射比浊法 抗原抗体结合形成复合物引起浊度变化，形成的浊度使光线的透过量减少,利用分光光度计测定光线被吸收的量，待测样品的抗原含量与吸光度成正比。2.散射比浊法利用激光照射在IC微粒上时部分光线发生散射的原理，通过测量散射光的强度来求得待测抗原的量. 速率法是以抗原抗体形成免疫复合物的速率峰值推算样品中蛋白含量的方法.。 终点法是让抗原和相应抗体作用一定时间，使反应达到平衡后，用散射比浊仪测量其散射光值。n免疫浊度法影响因素:n抗原抗体比例 基本原则是在反应体系中保持抗体过量n抗体质量 特异性 效价 亲和力 R型和H型抗体n抗原抗体反应的溶液：磷酸盐缓冲液n增浊剂的使用：PEG消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进IC的形成