【病毒学实验】第三次课3.4流感病毒的收获及血凝效价测定

实验二 流感病毒的收获及血凝效价测定 第一部分 流感病毒的收获 实验目的 掌握从鸡胚尿囊腔收获流感病毒的方法，获得大量的病毒抗原。 实验原理 将流感病毒接 种于鸡胚尿囊腔后， 病毒就在尿囊的内 胚层细胞繁殖，繁 殖12天后，病毒颗 粒释放至尿囊液中， 从而使尿囊腔中含 有大量病毒，通过收获尿囊液， 可以得到较大量的流感病毒。实验材料及器械 1. 已接种流感病毒的十日龄鸡胚 2. 无菌镊子、眼科剪刀、玻璃吸管、无菌EP管（1.5和10mL各一个） 3. 75酒精棉球实验方法与步骤1.收获时间根据不同的病毒而异，流感病毒一般培养3648小时即可进行收获。收获前一天晚上，将鸡胚于4冰箱过夜（如果急于收获亦可于20放置1小时左右），将鸡胚冻死，使红血球凝固，这样可避免在收获时流出的血细胞，同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度的下降。 4 冷藏时间不宜过长，过长易造成散黄，影响收获。快速冷冻时间也不易过长，一旦鸡胚冻成冰块就无法收获。2. 经过冰冻的鸡胚用碘酒、75酒精消毒鸡胚气室部卵壳3. 用无菌镊子将消毒过的壳打碎，轻轻揭去气室部位卵壳，撕去壳膜和绒毛尿囊膜，并将鸡胚轻轻推向一侧，压住。4. 用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔吸出尿囊液（无大血管处轻轻吸取清亮的黄色液体）。收取的尿囊液可无菌小瓶第二部分 血细胞凝集实验测定流感病毒效价 实验目的 掌握血凝试验的方法和原理，了解流感病毒具有凝集鸡红细胞的能力，掌握病毒类型的测定的一种方法。血凝原理血凝抑制原理实验材料及器械 1. 收获的尿囊液（即流感病毒）2. 1%鸡红血球、0.85生理盐水3. 血凝板、吸管、三角瓶实验方法及步骤1. 第1孔加入0.4ml尿囊液，第2孔加入0.1ml 尿囊液。2. 吸取0.9ml生理盐水于血凝板第2孔，从第3孔至第10孔每孔各加生理盐水0.4ml。3. 反复吹打34次第2孔，从混匀的第2孔中丢弃0.2ml，吸取0.4ml至第3孔混匀，再吸0.4ml至第4孔，依次稀释到第9孔，第9孔经稀释吹打后吸出0.4ml， 弃去，第10孔为血球对照，即不加尿囊液。 以上各孔（从第1孔到第10孔）的病毒的稀释度分别为：孔孔数数12345678910稀稀释释度度病毒原液1：101：201：401：801：1601：3201：6401：1280空白对照注意：各孔内液体量应为0.4ml4. 从第10孔开始，按10-1的方向，向每孔加0.4ml 1鸡红血球，轻轻振荡均匀，置室温45分钟后观察实验结果并记录，各孔的总体积应为0.8ml。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10病毒原液 红细胞对照 依次加入0.4ml 1鸡红血球实验结果判断 血凝结果以+、+、+、+、表示。 红细胞均匀分布于孔底者为+； 红细胞均匀分布于孔底，但有卷边现象为+，即不完全凝集； 红细胞在孔底形成一个中等大小环状，四周和中心有凝集以两个加号+表示。 红细胞在孔底形成一个小团，边缘光滑圆润者为，红细胞完全未被凝集；实验中应注意的一些问题 1. 实验所使用的玻璃器材及有机玻璃板均应干净，血凝板使用完毕及时处理，避免残留的酸、碱和沉着的红细胞影响实验结果 2. 流感病毒是对温度比较敏感的病毒，标本置于20时在一两个星期内会出现病毒效价减少的现象，一般需要在70 存放。 3. 一般采取公鸡的红细胞，而且存放时间超过一周就不可再用。红细胞采来后用PBS洗3到4遍，直到上清很清亮，放置后如果上清变红，说明有溶血，则不可再用。4. 温度、反应时间、反应体系对血凝试验的结果影响都很大。温度过高病毒毒力过强会出现溶血，不利于判定。反应的时间不能太长，对照孔出现沉淀就可以判定。思考问题思考问题加病毒液和红细胞悬液时为什么要反向加？血凝试验设置空白对照的意义？病毒悬液为什么采取倍比稀释而不是更高倍数如十倍比稀释？