发酵工程 复习整理资料

第一章 绪论生物技术：有时也称生物工程，是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。现代生物技术包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、生化工程。“发酵”定义 1.无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力H未经呼吸链传递而直接交给某一内源性中间代谢产物，以实现底物水平磷酸化的一类低效产能生物氧化反应称为发酵。（如酒精发酵） （微生物生理学上的定义、狭义、无氧）2.利用微生物的新陈代谢作用，把底物（有机物）转化成中间产物，从而获得某种工业产品。（工业上定义、广义、有氧无氧均可）乙醇发酵（酵母菌） 原料：糯米等淀粉原料 菌种：酵母该乙醇发酵过程在pH3.54.5以及厌氧的条件下发生。 发酵工程是研究利用微生物发酵作用为工业大规模生产服务的一门工程技术学科。 发酵工程：上游工程1.菌种选育2.培养基设计3.灭菌4.接种发酵过程控制 温度、pH、溶解氧、泡沫等下游工程1.产物提取、纯化、分析2.废弃物处理发酵流程课程学习任务 原料到产品整个过程。 发酵和提纯，发酵为主。(1)发酵部分:菌种、培养基、发酵机制、发酵工艺过程控制、发酵染菌的防治 (2)提纯部分：下游技术学会比拟放大（或称模型放大）的原理普遍 小型实验中间规模试验(中试)大型规模生产(工业化生产)发酵工程 斜面菌种摇瓶试验(培养基、 温度、 起始pH值、 需氧量、 发酵时间)小型发酵罐中试大规模工业生产 l 懂得分析和解决微生物工业生产中的具体问题，进一步提高发酵产品的质量和产率。 l 初步具备选育优良菌种，合理控制发酵条件和调节代谢途径的能力。 l 使生产过程连续化、自动化，探求新工艺、新设备和从事微生物工程研究和设计的能力。 发酵工业发展史1、自然发酵时期2、纯培养技术建立 (第一个转折期) 列文.虎克 巴斯德 科赫 布赫纳兄弟3、通气搅拌的好气性发酵工程技术建立(第二个转折期) 弗莱明4、人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术建立 (第三个转折期)5、发酵动力学、连续化、自动化工程技术的建立(第四个转折期) 6、生物合成和化学合成相结合工程技术建立(第五个转折期)化学工程与发酵工程o 本质区别 化学工程利用非生物催化剂;发酵工程利用生物催化剂酶o 利用微生物进行工业生产的优势 体积小、面积大，吸收多、转化快，生长旺、繁殖快，适应强、易变异，分布广、种类多o 微生物工程的难题(1)发酵部分:发酵醪(发酵醅、发酵液)不服从牛顿力学规律(2)提纯部分:需采取一些特殊的工艺措施并选用合适的设备 发酵工业发展趋势1、几个转变 l 分解代谢合成代谢l 自然发酵人工控制的突变型发酵代谢控制发酵通过遗传因子的人工支配建立的发酵（如工程菌） 2、化学合成与生物合成相结合 3、大型、连续化、自动化发酵 发酵罐的容量可达500t，常用的也达20-30t。4、人工诱变育种和代谢控制发酵 微生物潜力进一步挖掘，新菌株、新产品层出不穷。5、原料范围不断扩大 石油、植物淀粉、天然气、空气、纤维素、木质素等发酵工业范围 2 酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒） 食品工业（酱、酱油、食醋、腐乳、面包、酸乳）2 有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇） 抗生素发酵工业（青霉素、链霉素、土霉素等）2 有机酸发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等） 酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等）2 氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等） 核苷酸类物质发酵工业（肌苷酸、肌苷等）2 维生素发酵工业（维生素B12、维生素B2等）生理活性物质发酵工业（激素、赤霉素等）2 名贵医药产品发酵工业（干扰素、白介素等）微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、单细胞蛋白）2 微生物环境净化工业（利用微生物处理废水等）2 生物能源工业（沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等能源物质）2 微生物治金工业（微生物探矿、治金、石油脱硫等）第二章 发酵基础知识发酵产品类型 微生物菌体 1. 单细胞蛋白 （饲料添加剂、食品） 生产用原料：糖蜜、纸浆废液、谷氨酸发酵废液、稻草、稻壳、玉米芯、木屑等的水解液；天然气、乙醇、乙烷等；乳制品和啤酒生产的废弃物。 发酵方法：深层通气发酵和固体通风发酵。 主要用途：单细胞食品；食品添加剂、饲料添加剂；提取核苷酸、辅酶A、乳糖酶等医药及生物试剂 主要菌种：产朊假丝酵母、解脂假丝酵母、嗜石油假丝酵母等2.食（药）用菌 （蘑菇、香菇、灵芝、猴头等）3.微生物农药（细菌、真菌、病毒：苏云金杆菌、白僵菌）4.疫苗（细菌、病毒） 第一代：病原微生物及其产物 第二代：基因工程疫苗 第三代：人工合成疫苗5.微生态制剂（细菌：乳酸菌、双歧杆菌） 代谢产物 （分为初级代谢产物、次级代谢产物，这是一类当前最主要的微生物发酵产品，也是开发潜力最大的一类）；酒精、酱油、食醋、酸奶、谷氨酸、柠檬酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素、抗生素、毒素、激素、色素等 酶 酶制剂工业是利用微生物发酵，获得与生物体内的酶具有相同功能的酶制剂。 近几年，酶制剂的生产和应用研究已普遍引起各国的重视，已在食品、发酵、纺织、医药、造纸、皮革、化工、石油、畜牧饲料等部门得到应用。我国主要应用在食品方面，其中产量较大的是-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶、蛋白酶和脂肪酶。 发酵菌种 微生物菌体 1.单细胞蛋白：酵母、霉菌、细菌、藻类 2.食（药）用菌：大型真菌 3.微生物农药：细菌、真菌、病毒 4.疫苗：细菌、病毒 5.微生态制剂：细菌代谢产物 1、酒精饮料 啤酒：啤酒酵母 葡萄酒：酵母菌黄酒：霉菌（根霉、曲霉）、酵母菌、细菌 白酒：同黄酒2、调味品 豆腐乳：霉菌（根霉、毛霉、曲霉） 酱油：米曲霉、酵母菌属、片球菌属食醋：霉菌、酵母菌、醋酸菌 味精（谷氨酸钠）：谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌 柠檬酸：黑曲霉 火腿：曲霉、青霉 酸泡菜：肠膜状明串球菌、植物乳杆菌3、发酵乳制品 酸奶：乳酸菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸链球菌） 干酪：乳酸菌、青霉、丙酸菌等4、抗生素：放线菌、霉菌、细菌5、面包：啤酒酵母酶 主要是霉菌，其次是酵母菌和细菌 发酵三要素原料 传统工艺：原料选择菌种（为什么？） 发酵原料是一种选择培养基。传统工艺就是利用这种选择作用，把自然界带入的各种野生菌，在发酵基质上进行选择富集培养，这些微生物生长和代谢的结果可生产出有特殊风味的食品。 菌种 现代工艺：菌种选择原料（为什么？）在使用纯种发酵剂前，我们必须对原料进行灭菌，以防止其他杂菌对发酵的干扰。 工艺条件以适合菌种生长、繁殖与合成所需产物为依据，选择合适的温度、pH值、溶解氧、泡沫、氧化还原电位等。根据涉及到的微生物种类1、单菌发酵 现代发酵工业中最常见，传统发酵工业中很难实现。 2、混合菌发酵 自然发酵 人工接种发酵根据基质物理状态1、液态发酵 发酵基质呈流动状态，如啤酒发酵、柠檬酸发酵等。2、半固态发酵 发酵基质呈半流动状态，如黄酒发酵、传统稀醪酱油发酵等。3、固态发酵 发酵基质呈不流动状态。如固态酱油发酵、米醋发酵、大曲酒（白酒）发酵等。 发酵工艺流程菌种筛选 菌种纯化 摇瓶试验 小型发酵罐试验 种子罐扩大培养 发酵罐工厂化生产发酵产物形成过程（第一阶段） （第二阶段） （第三阶段）（原料预处理）（主发酵） （主、后发酵） （后发酵） 发酵产品的附加值一、发酵有利于食品保藏 食品发酵后，改变了食品的渗透压、酸度、水的活性等，从而抑制了腐败微生物的生长，有利于食品保藏。二、发酵产品的保健作用 有些食品经过微生物发酵后，不仅能产生酸类和醇类等，还能产生某些抗菌素可抑制致病菌和肠内腐败菌。有些发酵食品还具有预防心脑血管疾病、整肠、改善便秘、降低胆固醇、增加免疫功能和抗癌等功能。 三、发酵增加了食品的营养价值 发酵食品一般比未经发酵的原食品更富营养。一方面，发酵通过微生物对营养物质的降解作用，有利于营养物质的消化吸收。另一方面，食品经过发酵后可以提高某些营养组分如蛋白质的含量，并提高其吸收率，甚至通过微生物的发酵作用，还可以产生一些维生素。第三章 微生物工业菌种的选育与扩大培养微生物工业发酵的基本过程 发酵原料（玉米、米、薯干、植物、木材、石油等）菌种 预处理（初选、除杂、粉碎、水解等加工）选育 发酵培养基的配制（添加水、无机盐及其他营养物，调节碳氮比、pH值等） 活化（斜面） 灭菌扩大培养（摇瓶或 茄子瓶） 接种 发 酵进一步扩大培养 大型发酵（测量和控制发酵温度、pH值、（种子罐） 溶解氧等） 产物与细胞的分离（过滤、离心、沉淀等） 产物的精制（离子交换、层析、结晶、干燥等） 提 纯 产品菌种发展总趋势，如何理解 发酵菌 氧化菌 野生菌 变异菌自然选育 代谢控制育种 诱变育种 基因重组定向育种选择原则 生长能力强、对原料要求低、原料转化率高； 选择抗噬菌体能力强的菌株； 菌种纯，不易变异退化； 菌种不是病原菌，不产生任何有害物质； 发酵副产物少，产物容易分离； 选择单产高的营养缺陷型突变株、调节突变株或野生菌株 生产苏氨酸菌株转变成生产赖氨酸：高丝氨酸缺陷型高丝氨酸缺陷型菌株由于缺乏高丝氨酸脱氢酶，不能合成苏氨酸，从而走另一代谢途径，使赖氨酸大量积累。四大类微生物:细菌、酵母菌、霉菌和放线菌都可以用来生产工业产品。(见P7-8表1-1) 工业菌种选育 l 菌种来源 根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；通过菌种选育获得新的微生物菌种。 l 菌种选育定义 按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用自然菌种筛选、人工诱变育种、代谢控制育种或基因重组定向育种等方法得到优良菌种的工作。l 目的 理论上:人为地使某种产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝着人们所希望的方向引导，或者促使细胞内发生基因重组优化遗传性状，实现人为控制微生物。 工业上:提高产量、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用而改善菌种的特性。 4、方法 (1)自然选育 定义从自然界土壤、水、空气、动物、植物、矿物等样品中分离筛选得到菌种的方法。 图纸片培养显色法 饱浸含某种指示剂的滤纸片变色圈（如淀粉降解菌筛选） 变色圈法 指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液（如淀粉降解菌筛选） 透明圈法 固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈(如磷细菌筛选）生长圈法 利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物能力，工具菌就能围绕该菌生长（如营养缺陷型微生物为工具菌） 抑制圈法 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质（如抗生素产生菌筛选）(2)生产育种 长期生产过程中自然突变获得优良菌株。 (3)抗噬菌体菌株的选育（如去除吸附位点）(4)诱变育种 采用物理、化学诱变因素处理微生物细胞，提高基因的随机突变几率，然后通过定向筛选获得所需优良菌株。 图(5) 代谢控制育种 通过改变微生物菌种的代谢途径或代谢自动调节系统（如增加特定基因拷贝数来提高限速酶含量）而使微生物发生异常代谢，使所需中间代谢产物过量积累。 6) 基因重组定向育种 通过转化、转导、杂交和原生质体融合等遗传学方法和技术定向地重组微生物DNA，使微生物的功能发生定向的改变。 基因重组定向育种先进技术能取代传统育种方法吗？ 先进育种技术需在优良原始菌种基础上应用才有效。 基因重组产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质。 蛋白质类以外的很多发酵产物（如糖类、有机酸及次级代谢产物等）产生往往受到多个基因的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被确证。菌种衰退的概念 指菌种整体在多次接种传代过程中逐渐造成生产能力降低，表现为发酵力（如对培养基的利用）或繁殖力（如孢子的产生）下降或发酵产物得率降低的现象。 菌种衰退的常见现象 1.菌落和细胞形态的改变 2.生长速度缓慢，产孢子越来越少 3.抵抗力、抗不良环境能力减弱等 4.代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降 菌种衰退产生的原因 1.保藏不恰当 2.传代次数过多 3.发生回复突变 4.培养条件不适合 防止菌种衰退的方法 1.作好菌种保藏工作 2.尽可能使每次培养条件适合而一致 3.尽量减少传代次数 4.应使用幼龄菌培养菌种的复壮概念 狭义：在菌种已衰退情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退群体中找出少数未衰退的个体，以恢复原有典型性状的措施。广义：在菌种未衰退前经常有意识地进行纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。衰退菌种复壮的方法 l 单细胞菌株分离法 l 沸水筛选法 菌液用沸水处理后进行单细胞菌株分离，从而挑选出优良菌体。 l 改变培养条件法 采用有利于高产菌株而不利于低产菌株的条件来选出高产菌株。 l 通过宿主体复壮 如Bacillus thuringiensis的复壮 l 诱变处理法 对发生回复突变进行重新诱变育种。 工业菌种的保藏 1.原理 根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态(最好是休眠状态)。 2.原则 挑选优良纯种，最好是休眠体（如孢子、芽孢等），创造一个最有利于休眠的环境条件（如低温、干燥、缺氧、营养物质缺乏等），就可以达到菌种保藏的目的。同时，作为可行的方法，还要考虑方法的经济和简便。 3.方法 u 斜面低温保藏法 菌种在斜面培养基上培养，生长旺盛后存放在4-8的冰箱中，一般半年要移植一次。适合保藏实验室常用菌种。u 低温冰箱保藏法 菌种经液体培养后，加入无菌甘油，使甘油含量为30-40%，置于-80低温冰箱中保存，保存期为1-10年。适用于保存各类微生物菌体。 u 石蜡油封保藏法 医用石蜡油灭菌冷却后加在斜面菌种上,超过斜面顶部1cm，在室温下或冰箱里可保存1-10年。几乎所有微生物都适用。 u 砂土保藏法 将干的孢子、芽孢与彻底灭菌的砂土混合后装入砂土管，放入装有吸湿剂的干燥器或大试管中，加橡皮塞用蜡封严，置阴凉干燥处或冰箱中可保藏1-10年。适合于孢子、芽孢等的保存。u 硅胶保藏法 以纯净硅胶代替砂土,其他与砂土保藏法一样。 u 冷冻干燥保藏法 瓶中加入菌体或孢子悬液，-40低温冰箱冷冻1h，室温真空干燥固封，可保存10-数10年。适用于保存各类微生物菌体。保存运输方便。 u 液氮超低温保藏法 菌种密封于安踣瓶中, 慢速冻结器中以每分钟下降1的速度下降到-35，再迅速降温至-196，并在该温度下的液氮超低温罐中保存，保存期为3-9年。适用于保存各类微生物菌体。 微生物工业种子扩大培养 目的与任务 获得活力旺盛的、接种数量足够、纯而壮的培养物。 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。工艺 斜面 摇瓶 种子罐 发酵罐级数的确定 斜面菌种一级种子摇瓶培养二级种子罐培养发酵罐 （二级）斜面菌种一级种子摇瓶培养二级种子罐培养三级种子罐培养发酵罐 （三级）尽量采用二级发酵培养类型1、静置培养法（嫌气性发酵）在发酵槽等装置中不通空气进行发酵。如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等的发酵。2、通气培养法 （1）液体培养法 （2）固体培养法谷氨酸生产的种子制备 斜面菌种 一级种子（摇瓶） 二级种子(种子罐) 发酵1、斜面菌种培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5，琼脂 2%， pH 7.0-7.2培养条件：32，18-24h培养基特点：营养丰富，原料比较精细。 菌种要求： 生长良好，连续传代不超过3次。 ？2. 一级种子（摇瓶）培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养条件：1000ml三角瓶装液200ml,32培养12h。培养基特点：营养较丰富，原料比斜面培养基粗放。 ？3.二级种子(种子罐)培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养条件：种子罐（容积为发酵罐的1%），32，7-10h培养基的特点：营养较丰富，原料更粗放，接近发酵培养基种子的质量要求： 1.无杂菌 2.108-109个/ml 3.大小均匀，呈单个或八字排列4.PH 7.0-7.2时结束 5.活力旺盛第四章 发酵培养基的设计培养基种类 按成分不同划分(一) 天然培养基 由天然物质配制、成分不清楚、不稳定 麦芽汁培养基(二) 半组合培养基 主要由天然物质组成，加有某些化学试剂，最常用 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）(三) 组合培养基 由化学试剂配制、成分精确、稳定 高氏1号、查氏培养基按物理状态不同划分a) 固体培养基 液体培养基加入1.5-2.0%琼脂，成为固体状态(或大米、麸皮等组成） 常用来进行菌种分离、鉴定、保藏和活菌计数等b) 半固体培养基 琼脂含量一般为0.5% 观察微生物运动、菌种保藏，厌氧菌培养、分离、计数c) 液体培养基 不加任何凝固剂 大规模工业生产、实验室微生物基础理论和应用研究 d) 脱水培养基 含有除水外一切成分的干燥培养基按功能不同划分A) 选择培养基 加入特殊营养物，有利于所需微生物生长或抑制不需要微生物的培养基 加富性、抑制性选择培养基 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来1.在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；2.在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌3.在培养基中加入10酚可以抑制细菌和霉菌。B) 鉴别培养基 加有能与目的菌无色代谢产物发生显色反应的指示剂，只需用肉眼辨别颜色就能从近似菌落中找出目的菌 伊红美兰乳糖培养基（EMB）按培养目的不同划分1. 种子培养基 为种子扩大培养设计的培养基，营养较丰富，氮源比例较高。与发酵培养基接近。 2. 孢子培养基 用于孢子萌发，营养充足，容易吸收利用，抑制因子在许可范围内（如辛酸） 3. 发酵培养基 用于发酵工业，碳源含量较高。价廉易得，有利于下游的分离提取。发酵培养基的设计 设计目标 营养丰富而完备 PH适当而稳定 发酵单位高成本、单耗低 周期短 产品质量高 设计原则 明确目的 是实验室用还是工业大生产用，是种子扩大培养还是生产发酵产物？要求获得菌体还是积累代谢产物，是正常代谢产物还是异常代谢产物，是为异养菌设计的还是为自养菌设计的？ “投其所好” 用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量较高；用于生产代谢产物的发酵培养基氮源一般应比种子培养基低，若代谢产物是次级代谢产物，要考虑是否加入特殊物质；工业生产发酵培养基，应选择来源广泛、价格低廉的原料。设计基本步骤调查研究 菌种来源、生理特性、生物合成途径,产物化学性质、提炼方法、质量要求等，以便“投其所好”。培养基成分的确定 C/N比、重要金属非金属等、复合培养试验发酵条件的确定 温度、起始pH值、溶解氧、氧化还原电位、渗透压等 查阅文献，借鉴经验，借助单因子试验与复合因子试验（如正交试验法）等对培养基成分与发酵条件进行优化。补料 对碳及氮的代谢予以适当控制，或添加各种养料和前体物质。 不断完善 在生产实践过程中不断调整改进。 发酵原料转换及意义 节约用粮或以其它原材料代替粮食是当前微生物发酵工业值得研究的主要课题。 一方面可以从抓发酵的稳定和高产来节粮。另一个不可忽视的方面是原料的转换，开拓新的原料资源和微生物资源：野生植物淀粉、野生植物纤维、木屑水解物、石油原料与产品（如石蜡、醋酸、乙醇等）、空气原料（碳酸气） 前体物质是指在有些氨基酸、核苷酸、抗生素等发酵中添加一些特殊物质能获得较高的产率，它们在发酵中主要起避免反馈抑制、作为产物的前身等作用的特殊物质。 使用原则 加入应适量；可采用间歇分批添加或连续滴加的方法加入 P34 表2-15促进剂是指在氨基酸、抗生素和酶制剂发酵过程中，可以在发酵培养基中加进某些对发酵起一定促进作用的物质。酶制剂生产 加入某些诱导物、表面活性剂及其它一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。原理 启动微生物体内的产酶机构。改进了细胞的渗透性，同时增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。 抗生素生产中加入促进剂促进抗生素生物合成 原理Z 起生长因素作用 ； 推迟菌体自溶 Z 抑制了某些合成其它产物途径而使之向所需产物途径转化；降低了产生菌的呼吸 Z 改变发酵液的物理性质，改善通气效果 ； 与产物结合，防止反馈抑制 抗生素是一类由放线菌、细菌、霉菌等微生物产生的次生代谢产物，其微量就可以抑制其他微生物（包括病原菌、病毒）的生长、发育与代谢，有些能抑制癌细胞的生长和发育。 抗生素的用途E 治疗人类各种病症(如肺结核) ；用于饲料工业的添加剂(注意用量)E 食品工业的冷藏、冷冻的保存剂 ；防治农作物病虫草 （农用抗生素）菌种 放线菌、细菌、霉菌 (以放线菌为主)抗生素提纯 菌丝趋于衰老，有自溶现象出现时,需及时放罐提取。大多数抗生素是从滤液中提取的。提取方法: 1. 吸附法 利用活性炭、氧化铝等吸附剂吸附发酵液中的抗生素，再以适宜的pH值和洗脱剂洗脱，以达到浓缩和提纯目的。此法选择性不高，获得产品纯度较低。 2. 溶媒萃取法 利用抗生素在不同的pH值下在水或有机溶剂中的溶解度不同，反复提取以达到浓缩和提纯的目的。 3. 离子交换法 利用某些抗生素盐类可解离为阳离子和阴离子，经离子交换树脂达到提纯和浓缩的目的。 此法的优点是成本较低，产品纯度较高，在生产上较为经济和安全。4. 沉淀法 利用某些抗生素和酸碱或金属盐类，形成不溶性或溶解度极小的复盐，使抗生素从发酵液中沉淀析出，然后进一步精制 。新抗生素生产工业化的途径1.抗生素生产菌株的分离及筛选 大部分抗生素生产菌是从土壤中分离的，特别是富含有机氮的土壤，所以常用肥沃的菜园或森林等处的土壤作为分离抗生素生产菌的来源,进行分离和筛选。2.抗生性药理试验 分离的某一菌株可 使 用检定菌(如:病理性葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、真菌等)确证是否能生产抗生素物质。常用方法有：（1）交叉划线试验法 将被检菌以带状涂抹在琼脂平板(1条）上，置于2730环境下培养3d后，以直角交叉状划线接种数种检定菌测定阻止带的长度，可知道被检菌对各种检定菌的抗菌能力。 比较适用于不产生菌丝的被检菌，如细菌。（为什么？）（2）打点法 先将检定菌涂布培养在适当的平板培养基上，使其长满这个平板，将被检菌以打点的方式接种于检定菌的平板上培养，以比较阻止圆的直径大小可得知被检菌对检定菌的抗菌能力。适用于被检菌是任何菌种。3.生成新抗生素的确证 生成的抗生素到底是新产品还是已知的，就需对其进行一系列的试验，连续测定并记载此抗生素对各种检定菌的生长阻止情况，然后对照抗菌性带表，即可确定该抗生素的种类或为新品种。4.工业化阶段 如果发现了新的抗生素，还应该检测它对动物的毒性。如果得到了良好的临床应用试验结果，就可开始探讨工业生产的发酵条件，顺序为振荡培养、小型发酵槽、试验工厂等。包括确立培养基的组成、培养条件的选择和精制设计等等。同时在生产过程中应不断注意菌株的改良问题。第五章 发酵培养基的制备淀粉水解糖是指在工业生产上将淀粉水解为以葡萄糖为主的水解液的过程称为淀粉水解糖的制备，制得的水解液。（淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖） 在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。（广义）淀粉水解糖的制备方法与优缺点1、酸解法又称酸糖化法，它是以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。工艺流程：20%淀粉乳 加酸 水解 中和过滤活性碳脱色过滤淀粉水解糖优点： 缺点（1）水解时间短 （1）副反应多，产物纯度低 （2）所需设备少 （2）需耐腐蚀、高温、高压设备 增加了危险性与污染（3）生产能力大 （3）对淀粉原料要求高：颗粒小而均匀，淀粉乳浓度较低 原料较精细2、酶解法（双酶水解法）酶解法是指用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖，可分两步，液化：利用a-淀粉酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加的过程；糖化：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程 （狭义）优点： 缺点（1）副反应少，产物纯度高，质量好且出糖率高 （1）水解时间长 （2）条件温和，生产安全，污染少 （2）易造成过滤困难、泡沫多等问题（3）对淀粉原料要求较低；可用粗原料；淀粉乳浓度较高3、酸酶结合法 集中酸法与酶法优点、克服两者缺点的方法，可分为： 酸酶法 酶酸法 适用于：颗粒坚硬原料 颗粒不均匀、杂质较多原料 不适用于： 正好相反 缺点：设备较多、工艺较复杂制备方法选择：l 从水解糖液的质量和降低糖耗、提高原料利用率来说，选择酶法； l 从水解速度来说，选择酸法 ；l 综合考虑各方面因素，选择酸酶结合法，尤其是酶酸法 。糖蜜是甘蔗或甜菜制糖的副产物。发酵前对糖蜜进行稀释、酸化、灭菌及澄清等过程称为糖蜜前处理。种类：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。主要区别：甜菜中蔗糖较多，而转化糖含量极少，但总糖量接近。甘蔗糖蜜呈微酸性，而甜菜糖蜜则呈微碱性。甜菜糖蜜中总氮量较丰富。糖蜜作为发酵原料的适用性： 含糖量很高；主要含非结晶糖，回收困难；含大量的可发酵性糖，无需糖化。 糖蜜前处理的方法 1、加酸通风沉淀法 稀释酸化 通风澄清 2、加热加酸沉淀法 加热稀释酸化 澄清稀释 3、添加絮凝剂澄清处理法 稀释酸化加热加絮凝剂澄清谷氨酸发酵的糖蜜预处理 特殊性：生物素限量 原理：Z 产物谷氨酸积累到一定量会形成反馈抑制。需提高细胞膜的渗透性，使胞内的产生的谷氨酸迅速渗漏出去。Z 细胞膜由磷脂双分子层和蛋白质组成，磷脂双分子层由脂肪酸、甘油、磷酸和侧链组成。Z 把生物素控制在亚适量，才能生产出大量的谷氨酸。因为生物素是脂肪酸生物合成中乙酰-CoA羧化酶的辅基。谷氨酸发酵的糖蜜预处理的方法和各自原理1糖蜜预处理方法 除去过量生物素活性炭处理法 稀释，漂白粉，活性炭，过滤 原理：吸附树脂处理法 原理：吸附亚硝酸处理法 原理：破坏生物素2.添加化学药剂处理法 原理：增加细胞膜对谷氨酸的渗透性添加青霉素法 添加表面活性剂 添加抗氧剂法3.追加糖蜜法原理：当谷氨酸酶系统成熟时过量生物素不影响发酵，可在此时添加未处理的糖蜜进去继续正常生产。4.采用营养缺陷变异株 原理：诱变生物素缺陷型菌株为油酸缺陷型等，是生物素不再影响谷氨酸的积累纤维素代粮发酵背景 随着发酵工业的日益扩大，原料短缺问题越来越突出，迫切需要开辟新的原料途径。纤维素是自然界最丰富的可再生资源，开发纤维素代粮发酵具有非常广阔的前景。 现状： 纤维素的基本组成单位是葡萄糖，理论上来说，它是代替粮食的理想发酵原料。纤维素很难降解，特别是彻底降解成葡萄糖，所以降解成本较高。 纤维素降解目前主要方法： 蒸汽爆破，时间短，化学品用量少，能耗低 利用纤维素酶水解。构建基因工程菌，可直接利用纤维素进行发酵。 分解纤维素的微生物 好氧细菌粘细菌、镰状纤维菌和纤维弧菌厌氧细菌产纤维二糖芽孢梭菌、无芽孢厌氧分解菌及嗜热纤维芽孢梭菌。放线菌链霉菌属。 真菌青霉菌、曲霉、镰刀霉、木霉及毛霉第六章 糖嫌气性发酵产物积累机制发酵机制定义 指微生物通过其代谢活动，利用基质合成人们所需要的产物的内在规律。 正常产物：合适环境条件，酒精、乳酸等 异常产物：代谢控制，柠檬酸、谷氨酸等 代谢控制发酵是指人为地改变微生物的代谢调控机制，使有用中间代谢产物过量积累的发酵。1、生物合成途径 2、代谢调节机制 环境因素对代谢方向的影响 改变微生物代谢方向的措施 糖酵解途径（EMP途径）和巴斯德效应的三个关键酶均是是己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶。丙酮酸的去路 （P50 图3-2） 乙醇发酵（酵母） 乳酸发酵（乳酸菌）丙酸发酵（丙酸菌） 2,3丁二醇发酵 （产气杆菌） 混合酸发酵（大肠杆菌） 糖酵解的调节机制 1.能荷调节（主要） ATP抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性，使酵解减少，当需能反应加强，ATP分解为ADP和AMP，ADP、AMP增加、ATP的抑制作用被解除，同时ADP、AMP激活已糖激酶和磷酸果糖激酶，使6-磷酸葡萄糖、 1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油醛等增加，激活丙酮酸激酶，加快酵解。2.物质调节（次要） 无机磷解除6-磷酸葡萄糖对己糖激酶的抑制作用。 柠檬酸抑制磷酸果糖激酶。啤酒概述 酒精度 ：2%-5%，我国为0.5%-3.5%，目前趋势是往淡爽型发展优点：营养丰富、风味独特、含酒精低、容易吸收 啤酒种类 鲜啤酒：未经巴氏灭菌或超滤即出售。新鲜、爽口，保质期短。生啤酒：未经巴氏灭菌，但经超滤等进行无菌过滤后出售。新鲜、爽口，保质期较短。熟啤酒：经巴氏灭菌后出售。苦味增加，有熟味，保质期长。生产工艺 水， 酒之血：麦芽，酒之肉（骨）；酒花，酒之眼；菌种，酒之魂。1)原料 主要原料 水 大麦（麦芽）：以发芽力强，淀粉含量高，且蛋白质 含量少为好。 大麦先发芽以合成各种酶（包括淀粉酶、麦芽糖酶、蛋白酶等），以供制备麦芽汁（糖化）的催化剂。 辅助原料 大米、玉米：以淀粉含量高的新鲜糯米为好。可提高出酒率，降低成本。啤酒花：一种蔓藤性植物的未受精的雌花。啤酒花的作用： 1.酒花油与苦味酸赋予啤酒独特的香味和爽口的苦味；2.酒花树脂可提高啤酒泡沫持久性； 3.沉淀蛋白质，有利于啤酒澄清；4.抑菌防腐。-淀粉酶：降低生产成本，提高出酒率，改善啤酒风味和色泽。2)菌种 啤酒酵母：将糖进行酒精发酵，生成二氧化碳和乙醇。3)原理 大麦经发芽得到麦芽。麦芽糖化所得糖在啤酒酵母作用下进行酒精发酵生成二氧化碳和乙醇。同时，麦芽在发酵过程中产生了有机酸、高级醇和酯类，与啤酒花共同形成啤酒独特的风味。工艺流程 图 操作要点： （1）麦芽制备 浸渍：精选大麦浸水至水分达43-48%。 发芽：浸渍后的大麦移至发芽箱，先调节温度为13-15，随后每天约增加1，保持适量水分和氧气。8d完成发芽，得到生麦芽称绿麦芽，约含45%水分。焙炒：为防止绿麦芽过分生长，抑制麦粒中酶的作用以提高储藏性，应立即焙炒与干燥至含水量为3%。焙炒过程中，麦芽中的糖及氨基酸反应生成褐色色素，并除去生臭，使麦芽具有特有的香味和色泽，同时使根芽容易脱落。 干燥：仅进行焙炒往往达不到含水量要求，所以还必须进行干燥处理。为避免麦芽的萎缩硬化，初期低温，随后逐渐提高干燥温度，最后80-85强热3-5h，然后用除根机处理，除根是为了去除涩味。最后将成品麦芽储藏与20以下。（2）麦芽汁制备 糖化：将麦芽粉碎后与温水混合，借助麦芽自身的各种水解酶，或适当添加-淀粉酶， 在65下将淀粉和蛋白质等高分子物质进一步分解成可溶性低分子糖类、糊精、氨基酸、胨、肽等。 添加啤酒花、煮沸：糖化液经过滤加入啤酒花0.18-0.2%（淡色啤酒），煮沸1-2h。过滤除去酒花残渣，冷却后移入发酵罐。加入酒花煮沸的作用：使麦汁浓缩到适合浓度； 溶出酒花有效成分，增加麦汁的香气、苦味、防腐能力；使麦汁残留的蛋白质凝固除去，防止带来浑浊，增进啤酒的透明度和稳定性；破坏全部酶，具杀菌作用。（3）主发酵 低泡期：接种后15-20h，发酵罐四周出现白沫并向中间扩展直至全液面。此期每天糖度下降1Bx，温度上升0.9-1。 高泡期：发酵最旺盛期，泡沫特别丰盛，达20-30cm厚。降糖速度最快，可达每天1.5Bx。温度上升很快，应密切注意降温。此阶段可维持2-4d。落泡期：温度开始下降，降糖速度减慢，泡沫开始收缩，形成褐色泡盖。当12度酒糖度降至3.8-4.8 Bx时，即可下酒进入后酵。此阶段维持约2-3d。 （4）后发酵 下酒：将经主发酵的酒送入后酵罐（储酒罐）称为下酒。下酒前，先在储酒罐里放满无菌水，用二氧化碳将水压出，充满后，将酒液注入。要求尽可能一次灌成，流空隙10-15cm。管理：下酒后先开口发酵。以防二氧化碳过多，酒沫涌出，2-3d后封口。下酒初期室温2.8-3.2，以后逐渐降到0-1。12 Bx酒储酒时间为1-3个月。（5）过滤 经后发酵的啤酒，残存酵母和蛋白质等沉积于底部或悬浮于酒中，需经过滤或分离。常用分离方法有：滤棉法，较古老，趋于淘汰；硅藻土法；离心分离法；板框过滤法；微孔薄膜过滤法。 选择方法的原则有产量大，质量高，损失小，劳动强度小，二氧化碳损失少，不易污染，不影响风味，不吸氧等。（6）包装 将鲜啤酒经超滤，则得生啤酒。 过滤后的啤酒，不经灭菌处理而作为鲜酒出售，这就是通常所称的鲜啤酒。 将鲜啤酒用巴氏灭菌法灭菌，即装瓶后，在60下保持20min，可杀死酵母和其他非孢子细菌，即得熟啤酒，可作较长时间的保存。酒精发酵机制 乙醇生成途径 见ZL1图 巴斯德效应概念 在好气条件下，酵母发酵能力降低的规律称为巴斯德效应。其现象是乙醇的积累减少，实质是细胞内糖代谢降低。巴斯德效应机制 好氧，进入TCA，产生的柠檬酸、ATP抑制磷酸果糖激酶。 6-磷酸果糖积累，进而6-磷酸葡萄糖积累，抑制已糖激酶。 1，6-二磷酸果糖减少，对丙酮酸激酶激活作用减弱，磷酸烯醇式丙酮酸积累，抑制已糖激酶。第七章 柠檬酸发酵机制柠檬酸生产工艺 概述 柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界分布很广，主要存在柠檬、柑橘、凤梨、无花果等果实中，尤其以未成熟者含酸量较多。柠檬酸具有令人愉快的爽口酸味，安全无毒，是发酵法生产的最重要有机酸。在水中的溶解度极高，能被生物体直接吸收代谢。柠檬酸用途 在食品工业上 用作清凉饮料、糖果业等的酸味料。 由于柠檬酸是水果的天然成分，不仅是良好的酸味剂，同时具有增溶、缓冲和抗氧化作用，使饮料中的其他成分交融协调，形成调和的口味和气味。 也可用作油脂等的抗氧化剂。 在医药上 柠檬酸钠用作输血剂，柠檬酸铁铵用作补血剂。同时可用于血液和血浆的保存，以及制造人造血浆等。 因为柠檬酸具有抗凝血作用，同时溶解度高，酸根能被直接吸收代谢而无积累。 在化学工业上 缓冲剂、催化剂、激活剂、增塑剂、鳌合剂、吸附剂、稳定剂、消泡剂等 在日常生活中 保健饮品 原料与菌种： 1.糖质原料（常用）：此类原料可以是淀粉质原料，如薯干，也可以是废糖蜜。 菌种为黑曲霉。 2.石油原料：以石油中的十四碳到十八碳的直链烷烃混合物（即石蜡）为原料进行发酵。菌种为解脂假丝酵母。工艺流程注释调浆 加入适量水，使薯干粉浓度为1016%，调成浆状。 接种培养 将薯干粉浆移入发酵罐，接入适量经培养的黑曲霉种子，在控制pH为2.02.5,温度31左右下，培养发酵。 加热,菌丝过滤 发酵液成熟后，将发酵液先加热到100再用板框压滤或真空抽滤进行过滤。发酵液加热到100目的：加热可促使蛋白质凝固，加快过滤速度；可杀死微生物；菌丝加热后会膨胀破裂，可使柠檬酸释放来，提高收率 碳酸钙中和 在发酵液中加入碳酸钙，使柠檬酸转化成难溶的柠檬酸钙。酸解 在得到的柠檬酸钙中加入硫酸，用量一般为碳酸钙的9295%。酸解温度为85，并过滤。脱色 在85下，用活性炭或脱色树脂柱除去色素。树脂法除金属离子 采用离子交换树脂，除去酸解液中混入的钙、铁等离子 浓缩与结晶 采用减压浓缩，要求真空度600740mmHg，温度5060下进行浓缩与结晶。干燥 采用沸腾干燥箱。干燥温度控制在35以下，否则会失去一部分结晶水影响成品的色泽。柠檬酸生物合成途径 见ZL11图 葡萄糖经过EMP途径生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-COA；另一方面丙酮酸羧化作用生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰-COA在柠檬酸合成酶作用下缩合生成柠檬酸。 柠檬酸代谢调节机制的几个问题 柠檬酸抑制磷酸果糖激酶，柠檬酸过量积累与EMP途径的畅通存在尖锐的矛盾，这个矛盾如何解决？柠檬酸过量积累与EMP途径畅通的矛盾如何解决？1.锰离子缺乏抑制蛋白质合成，导致细胞内NH4+浓度升高，解除了柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制。2.有氧时黑曲霉走不产ATP的侧系呼吸链，解除了ATP对磷酸果糖激酶的抑制。 柠檬酸要过量积累，三羧酸循环的大部分必然被阻断，那么草酰乙酸从何而来？PYR（丙酮酸）+CO2草酰乙酸+ADP+Pi（Keq=0.818丙酮酸羧化酶 其中以第一个反应为主?PEP （磷酸烯醇丙酮酸）+CO2草酰乙酸+ADP+ATP（Keq=0.049） 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 黑曲霉生产柠檬酸，有那些特有的优势？ 见书P59-63 柠檬酸为什么能过量积累？o 锰离子缺乏，抑制蛋白质合成，导致NH4+浓度升高，有氧时黑曲霉走不产ATP的侧系呼吸链，解除了对磷酸果糖激酶的抑制，促进EMP途径畅通。o 丙酮酸羧化酶不被调节控制，源源不断提供草酰乙酸。o 丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA和两个CO2固定反应的平衡，及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。o 顺乌头酸水合酶催化建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，造成柠檬酸最初的积累。o 柠檬酸的积累使pH值下降，抑制了异柠檬酸脱氢酶和顺乌头酸水合酶的活力，促进了自身进一步积累。调节措施（总结）1、菌种 选育优良菌株2、发酵条件 锰离子缺乏 有氧 控制Fe2+含量 pH值2.0-2.5左右 第八章 谷氨酸发酵机制味精生产工艺概述：L-谷氨酸一钠盐，俗称味精，学名-氨基戊二酸一钠，分子式NaC5H8O4NH2O。它有强烈的肉类鲜味，用水稀释至3000倍，仍能感觉到鲜味。故广泛用于食品菜肴，一般用量为0.2-0.5%的浓度。 生理功能： 被消化吸收构成人体组织中的蛋白质，并参与体内许多其它代谢过程。可与血氨结合生成谷氨酰胺，能解除组织代谢过程中产生的氨的毒害作用，从而可以预防和治疗肝昏迷等病症。可抑制厌食症、偏食症。长期食用，可提高神经有缺陷儿童的智力。生产工艺1、原料 淀粉 大米 废糖蜜 淀粉糖化液 2、菌种 谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌 现普遍使用T613，优点为耐高温、生长快、产酸高。3、工艺过程及原理 淀粉水解糖的制备 原理 将淀粉先用-淀粉酶液化，后在高温下加酸糖化得到葡萄糖。（酶酸法）工艺流程 发酵 原理 使微生物在特定条件下改变原来的代谢途径，从而积累大量中间代谢产物谷氨酸。工艺流程（斜面） （摇瓶） （种子罐） （发酵罐） 谷氨酸提取 原理 等电点锌盐法1.谷氨酸在等电点时溶解度最低。将发酵液pH调至等电点3.22，在冷冻条件下谷氨酸析出。2.谷氨酸母液仍为谷氨酸饱和溶液，利用谷氨酸锌难溶的性质。采用冷冻pH6.3（谷氨酸锌等电点）条件下，将谷氨酸锌沉淀。 3.在酸性条件下，溶解谷氨酸锌，再调pH至3.22，谷氨酸结晶析出。工艺流程 粗谷氨酸制味精 原理 谷氨酸与碳酸钠进行中和制成谷氨酸钠，才具有强力鲜味。同时经过一系列的精制过程，才得到符合质量标准的味精。工艺流程谷氨酸生物合成途径 见ZL11图 糖经酵解途径（EMP）和磷酸己糖途径（HMP）生成丙酮酸。丙酮酸经氧化脱羧生成乙酰-CoA，经CO2固定生成草酰乙酸，两者合成柠檬酸进入三羧酸循环，由三羧酸循环的中间产物-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。谷氨酸代谢调节机制的几个问题 谷氨酸合成有那些关键酶，这些酶对于谷氨酸合成的调节机制？1.EMP途径与TCA循环中的一些关键酶。3个 己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶2.在谷氨酸之前的酶活性需保证。4个 柠檬酸合成酶 顺乌头酸水合酶 异柠檬酸脱氢酶 谷氨酸脱氢酶3.在谷氨酸之后的酶活性需抑制。 2个 异柠檬酸裂解酶 -酮戊二酸脱氢酶 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制如何消除？ NH4 谷氨酸脱氢酶葡萄糖中间产物a酮戊二酸 谷氨酸 低浓度的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶有显著的激活作用，只有较高浓度谷氨酸才抑制其自身的生成。只要将培养基的生物素控制在一定的浓度，保证细胞膜的通透性，使得生成的谷氨酸能够及时地渗透出来，则谷氨酸就不会对谷氨酸脱氢酶形成反馈抑制。 读表5-3，解释之。 现象：（1）生物素贫乏培养基中积累大量谷氨酸，生物素丰富培养基中几乎不积累谷氨酸。（2）生物素贫乏培养基培养的细胞内谷氨酸含量较生物素丰富的培养基中培养的少，且较容易洗出。机理： 生物素是脂肪酸生物合成中的辅酶，生物素缺乏时，不饱和脂肪酸合成受阻，造成磷脂含量不足，细胞膜结构不完整，提高了通透性，有利于谷氨酸分泌到培养基中，消除了谷氨酸对其自身合成的抑制，同时谷氨酸也较容易洗脱。 菌种选育模型与控制方法原理？ 1）生物素缺陷型2）油酸缺陷型3）甘油缺陷型4）温度敏感突变株谷氨酸分泌受细胞膜控制，影响细胞膜通透性的主要是膜中磷脂的含量。磷脂由不饱和脂肪酸、甘油、磷酸和侧链组成，因此控制油酸、甘油等的合成可增加细胞膜通透性，从而有利于谷氨酸的渗透，消除反馈抑制。调节措施（总结）1、菌种 选育，如对氟乙酸抗性菌株2、发酵条件 生物素限制 氟乙酸控制 锰离子缺乏？ 第九章 发酵工艺过程的控制温度的控制 温度对微生物生长与发酵的影响1、对菌体所有结构物质都有作用 2、直接