基因工程制药中PPT课件

三 、 酵 母 中 的 基 因 表 达 1.载 体 ：（ 1） 根 据 载 体 的 复 制 序 列 可 分 为 4类 ： YEp（ 酵 母 附 加 体 质 粒 ） 、YRp（ 酵 母 复 制 型 质 粒 ） 、 YCp（ 酵 母 着 丝 粒 质 粒 ） 、 Yip（ 酵 母 整合 质 粒 ） 。YEp： 此 类 载 体 以 酵 母 的 天 然 2质 粒 为 基 础 ， 带 有 2质 粒 复 制 区 序列 ， 拷 贝 数 高 ， 转 化 频 率 高 、 稳 定 性 好 ， 应 用 较 广 。YRp： 复 制 序 列 为 非 2来 源 的 自 主 复 制 序 列 ， 稳 定 性 差 ， 拷 贝 数 少YCp： 有 ARS、 端 粒 、 着 丝 粒 等 ， 类 似 于 染 色 体 的 行 为 ， 稳 定 性 好 ，但 拷 贝 数 只 有 1个 。YIp： 可 完 全 整 合 到 酵 母 染 色 体 中 ， 稳 定 性 好 ， 但 拷 贝 数 只 有 1个 。 （ 2） 酵 母 克 隆 载 体 ： 含 有 大 肠 杆 菌 的 复 制 原 点 和 抗 性 基 因 ， 可 在 大 肠 杆 菌 中 克 隆 增 殖 也 可 在 酵 母 中 进 行 复 制 和 表 型 选 择 。 酵 母 表 型 选 择 为 营 养 缺 陷 型（ 合 成 氨 基 酸 或 核 苷 酸 的 酶 系 突 变 缺 失 ） 或 抗 性 筛 选 。（ 3） 表 达 载 体 ： 将 酵 母 菌 的 启 动 子 和 终 止 子 等 有 关 控 制 序 列 引 入载 体 的 适 当 位 点 后 ， 就 构 成 了 酵 母 菌 的 表 达 载 体 。 普 通 表 达 载 体 ： 只 能 方 便 引 入 外 源 基 因 并 进 行 表 达 ， 对 表 达 产 物的 组 成 ， 特 别 是 对 其 N末 端 氨 基 酸 是 否 增 加 并 无 严 格 要 求 。 精 确 表 达 载 体 ： 要 求 在 启 动 子 或 前 导 肽 编 码 序 列 的 适 当 部 位 有 内切 酶 位 点 ， 以 利 于 插 入 外 源 基 因 ， 并 使 其 在 表 达 加 工 后 N末 端 氨 基酸 序 列 与 天 然 产 物 相 同 。 如 在 构 建 -因 子 精 确 表 达 载 体 时 ， 在 其Arg85后 引 入 酶 切 位 点 ， 同 时 Arg也 为 酵 母 蛋 白 酶 断 裂 位 点 。 TELURA3 2 Ampr TcrURA3 YIpYEp YRpYLp pYAC Ampr AmprAmpr Ampr TcrTcr TcrTcr URA3OriOri OriOri CENYCp Ampr TcrURA3OriTRP1HIS4 TELTELTEL 2 URA3 Ampr TELARS 2.影 响 目 的 基 因 在 酵 母 菌 中 表 达 的 因 素（ 1） 外 源 基 因 的 拷 贝 数 ： 有 些 酵 母 质 粒 导 入 细 胞 后 在 传 代 培 养 中丢 失 ； 整 合 质 粒 很 稳 定 ， 但 拷 贝 数 低 ， 不 能 高 效 表 达 ； 高 度 稳 定 的高 拷 贝 数 的 质 粒 可 使 外 源 基 因 高 效 表 达 ， 但 高 拷 贝 数 常 会 引 起 细 胞生 长 量 的 降 低 。（ 2） 外 源 基 因 的 表 达 效 率 ： 主 要 与 启 动 子 、 分 泌 信 号 和 终 止 序 列有 关 。 启 动 子 ： 由 上 游 激 活 序 列 和 保 留 的 近 端 启 动 子 组 成 。 近 端 启 动 子含 有 转 录 必 须 的 TATA序 列 和 mRNA起 始 转 录 位 点 ATG。 终 止 子 区 含有 终 止 转 录 所 需 信 号 。组 成 型 启 动 子 ： 如 果 外 源 基 因 表 达 产 物 对 酵 母 细 胞 不 利 ， 会 使 细 胞生 长 不 良 ， 达 不 到 所 需 的 细 胞 密 度 。 诱 导 型 启 动 子 ： 分 泌 信 号 的 效 率 ： 分 泌 信 号 包 括 信 号 肽 部 分 及 前 导 肽 部 分 的 编 码序 列 ， 可 帮 助 表 达 产 物 分 泌 出 酵 母 细 胞 并 在 适 当 部 位 由 胞 内 蛋 白 酶加 工 切 断 表 达 产 物 与 前 导 肽 之 间 的 肽 键 ， 产 生 正 确 的 表 达 产 物 。 终 止 序 列 的 影 响 ： 终 止 序 列 保 证 了 转 录 产 物 在 适 当 部 位 终 止 和 加上 polyA尾 巴 ， 这 样 形 成 的 mRNA才 能 比 较 稳 定 并 被 高 效 翻 译 。（ 3） 外 源 蛋 白 的 糖 基 化 ： N-糖 苷 键 、 O-糖 苷 键 （ 4） 宿 主 菌 株 的 影 响 ： 菌 体 生 长 能 力 强 菌 体 内 源 蛋 白 酶 较 弱 菌 株 性 能 稳 定 分 泌 能 力 强 （ 3） 某 些 酵 母 表 达 系 统 具 有 外 分 泌 信 号 序 列 ,能 够 将 所 表 达 的 外 源蛋 白 质 分 泌 到 细 胞 外 ,因 此 很 容 易 纯 化 。（ 1） 酵 母 生 长 繁 殖 速 度 迅 速 ,能 够 耐 受 较 高 的 流 体 静 压 ,用 于 表 达 基因 工 程 产 品 时 ,可 以 大 规 模 生 产 ,有 效 降 低 了 生 产 成 本 。（ 2） 酵 母 表 达 外 源 基 因 具 有 一 定 的 翻 译 后 加 工 能 力 ,收 获 的 外 源 蛋白 质 具 有 一 定 程 度 上 的 折 叠 加 工 和 糖 基 化 修 饰 ,性 质 较 原 核 表 达 的 蛋白 质 更 加 稳 定 ,特 别 适 合 于 表 达 真 核 生 物 基 因 和 制 备 有 功 能 的 表 达 蛋白 质 。 ：（ 1） 在 培 养 基 中 加 入 富 含 氨 基 酸 和 多 肽 的 蛋 白 胨 或 酪 蛋 白 水 解 物 ,通 过 增 加 酶 作 用 底 物 来 缓 解 蛋 白 水 解 作 用（ 2） 将 培 养 基 的 pH 值 调 成 酸 性 (酵 母 可 在 pH 3. 0 8. 0 的 范 围 内生 长 ) ,以 抑 制 中 性 蛋 白 酶 的 活 性 ;（ 3） 利 用 蛋 白 酶 缺 失 酵 母 突 变 体 进 行 外 源 基 因 的 表 达 。产 物 蛋 白 质 的 不 均 一（ 2） 信 号 肽 加 工 不 完 全（ 3） 内 部 降 解（ 4） 多 聚 体 形 成 等 ,造 成 表 达 蛋 白 质 在 结 构 上 的 不 一 致 。（ 5） 还 时 常 遇 到 表 达 产 物 的 过 度 糖 基 化 情 况 。 （ 1） 增 加 整 合 在 酵 母 染 色 体 上 的 目 的 基 因 剂 量（ 2） 控 制 外 源 基 因 中 的 AT 含 量 （ 3） 选 择 最 为 合 适 的 信 号 肽（ 4） 外 源 基 因 在 酵 母 菌 表 达 的 影 响 因 素 还 有 很 多 , 如 整 合 位 点 、mRNA 5和 3非 翻 译 区 (U TR) 、 宿 主 菌 的 Mut 表 型 、 蛋 白 酶 、 表 达蛋 白 质 自 身 的 特 点 、 培 养 基 及 培 养 的 环 境 条 件 等 ,有 效 控 制 各 种 影 响表 达 的 因 素 ,对 于 外 源 基 因 的 高 效 表 达 都 必 不 可 少 。 （ 1） ( S accharomyces cerevisiae) ： 难 于 高 密 度 培 养 ,分泌 效 率 低 ,几 乎 不 分 泌 分 子 量 大 于 30 kD 的 外 源 蛋 白 质 ,也 不 能 使 所表 达 的 外 源 蛋 白 质 正 确 糖 基 化 ,而 且 表 达 蛋 白 质 的 C 端 往 往 被 截 短 。（ 2） 表 达 系 统 ： 包 括 ( Hansenula ) , ( Pichia) , ( Torulopsis) 等 ,能 在 以 甲 醇 为 唯一 能 源 和 碳 源 的 培 养 基 上 生 长 ,甲 醇 可 以 诱 导 它 们 表 达 甲 醇 代 谢 所 需的 酶 , 如 醇 氧 化 酶 (AOX1) 等 。（ 3） ( Schizogenesis pombe) 表 达 系 统 ： 具 有 许 多 与 高等 真 核 细 胞 相 似 的 特 性 ,它 所 表 达 的 外 源 基 因 产 物 具 有 相 应 天 然 蛋 白质 的 构 象 和 活 性 ， 但 目 前 研 究 较 少 。 （ 1） 将 目 的 基 因 克 隆 入 酵 母 表 达 载 体（ 2） 用 适 当 的 限 制 性 内 切 酶 消 化 重 组 质 粒 ,使 之 线 性 化（ 3） 将 线 性 化 的 重 组 质 粒 转 化 入 酵 母 菌 株 (如 GS115 , KM71)（ 4） 将 转 化 物 接 种 HIS4 缺 陷 平 板 进 行 第 一 轮 筛 选（ 5） 用 不 同 浓 度 的 G418 平 板 进 行 第 二 轮 筛 选（ 6） 挑 选 10 20 个 克 隆 进 行 小 规 模 诱 导 培 养 ,鉴 定 外 源 基 因 的 表 达量（ 7） 挑 选 高 水 平 表 达 菌 株 进 行 大 规 模 诱 导 培 养 ,以 制 备 外 源 基 因 的表 达 蛋 白 质 。 ： 单 细 胞 真 核 微 生 物 ， 被 称 为 真 核 生物 中 的 “ 大 肠 杆 菌 ” ， 最 早 应 用 于 酵 母 基 因 克 隆和 表 达 的 宿 主 菌 。 1981年 用 酿 酒 酵 母 表 达 人 干 扰素 获 得 成 功 后 ， 人 们 还 用 酿 酒 酵 母 表 达 了 多 种 原核 和 真 核 蛋 白 。 （ 1） ： 整 合 型 载 体 ， 不 含 酵 母 DNA 复 制 起 始 区 ， 不 能在 酵 母 中 进 行 自 主 复 制 ， 含 有 整 合 介 导 区 ， 此 载 体 整 合 到 染 色 体 上 ，稳 定 性 高 ， 缺 点 为 拷 贝 数 低 。： 用 酵 母 转 座 子 以 产 生 多 个 插 入 拷 贝 ； 将 re-DNA插 入 到 核糖 体 rDNA中 ， 在 宿 主 染 色 体 上 以 150 串 联 重 复 序 列 存 在 。1、 载 体（ 2） ： 附 加 型 载 体 ， 含 有 酿 酒 酵 母 2 质 粒 DNA 复 制 有关 的 部 分 或 全 部 序 列 , 常 以 30 或 更 多 拷 贝 存 在 ， 但 不 稳 定 ,能 独 立 于酵 母 染 色 体 之 外 复 制 ， 为 穿 梭 质 粒 。： 以 脆 弱 的 srbl-1 突 变 的 宿 主 株 为 基 础 建 立 自 然 选择 系 统 , 这 个 菌 株 要 求 渗 透 压 稳 定 ， 否 则 会 裂 解 ， 转 化 后 带 野 生 型SRB 的 自 主 复 制 YEp 型 质 粒 与 此 菌 株 进 行 互 补 ， 可 在 培 养 基 上 保持 选 择 性 。 2、 宿 主 菌 酿 酒 酵 母酿 酒 酵 母 基 因 组 序 列 早 在 1996 年 就 完 成 ， 它 有 16 条 染 色 体 ， 约6000 个 ORF， 仅 4%的 酵 母 基 因 有 内 含 子 。目 前 利 用 酿 酒 酵 母 为 宿 主 系 统 表 达 了 多 种 外 源 基 因 产 物 ， 如 乙 型 肝炎 疫 苗 、 人 胰 岛 素 、 人 粒 细 胞 集 落 刺 激 因 子 、 人 血 管 抑 制 素 等 。外 源 基 因 可 在 酿 酒 酵 母 中 分 泌 表 达 ， 通 常 为 将 重 组 蛋 白 的 成 熟 蛋 白形 式 与 结 合 信 息 素 的 pre-pro 序 列 融 合 ， pro 序 列 可 用 Kex2 酶 的 蛋白 水 解 作 用 切 去 ， 这 个 步 骤 是 广 泛 存 在 于 真 核 生 物 中 的 ， 表 达 产 物分 泌 至 胞 外 不 仅 有 利 于 纯 化 ， 而 且 避 免 了 产 物 在 胞 内 大 量 蓄 积 对 细胞 的 不 利 影 响 。 第 一 个 商 品 化 的 重 组 疫 苗 来 自 酿 酒 酵 母 。 （ 1） 转 录 水 平（ 2） 表 达 载 体 的 拷 贝 数 和 稳 定 性（ 3） 胞 内 表 达 产 物 的 加 工 和 修 饰（ 4） 分 泌 表 达 产 物 的 加 工 和 修 饰 等 等 。 利 用 酿 酒 酵 母 表 达 系 统 生 产 制 备 外 源 基 因 的 表 达 产 物 已 有20 余 年 的 历 史 ， 但 实 践 中 仍 然 发 现 有 很 多 的 外 源 基 因 不能 在 酵 母 表 达 系 统 中 表 达 ， 具 体 原 因 目 前 还 没 有 明 确 。 另 外 ， 还 没 有 彻 底 克 服 酵 母 表 达 系 统 制 备 外 源 蛋 白 质 时 发生 的 不 均 一 现 象 。 （ 1） 能 利 用 甲 醇 作 唯 一 碳 源 的 一 类 酵 母 ,其 代 谢 甲 醇 的 第一 步 是 在 醇 氧 化 酶 的 作 用 下 甲 醇 被 氧 化 成 甲 醛 ， 调 节 这 种酶 的 启 动 子 是 强 启 动 子 并 严 格 受 甲 醇 诱 导 ,因 此 可 用 于 调控 外 源 蛋 白 表 达 。（ 2） 甲 醇 酵 母 能 在 无 机 盐 培 养 基 中 快 速 生 长 ,易 进 行 工 业化 大 生 产 ,高 密 度 培 养 干 细 胞 量 可 达 100g/ L以 上 ， 外 源 蛋白 的 表 达 量 比 酿 酒 酵 母 增 加 10- 100 倍 。 （ 3） 能 对 重 组 蛋 白 进 行 翻 译 后 必 要 的 剪 接 、 正 确 的 折 叠和 修 饰 ,糖 基 化 也 更 接 近 高 等 真 核 生 物 甚 至 人 类 。（ 4） Pichia pastoris 、 Pichia methanolical 、 Hansenula polymorpha、 Candida biodinii 等 甲 醇 酵 母 已 发 展 成 为 高效 的 表 达 系 统 , 已 成 功 表 达 了 多 种 重 组 蛋 白 并 显 示 出 巨 大的 优 越 性 ， 成 为 目 前 基 因 表 达 优 先 考 虑 的 表 达 系 统 。 具 有 强 有 力 的 、 易 控 制 的 AOX启 动 子 ,可 严 格 调 控 外 源 蛋 白 的 表 达 ; 可 对 表 达 蛋 白 进 行 翻 译 后 加 工 和 修 饰 ,即 二 硫 键 的 形 成 、 蛋 白 磷 酸 化 、 折 叠 、 信号 序 列 加 工 、 N-糖 基 化 、 O-糖 基 化 ,从 而 使 表 达 出 的 蛋 白 具 有 生 物 活 性 ; 对 营 养 要 求 低 ,生 长 快 , 培 养 基 廉 价 ,便 于 工 业 化 生 产 ; 可 高 密 度 发 酵 培 养 ,蛋 白 产 量 高 ; 表 达 量 高 ,如 破 伤 风 毒 素 C 片 段 表 达 量 高 达 12 g/ L; 甲 醇 酵 母 自 身 分 泌 的 背 景 蛋 白 少 ,表 达 产 物 较 易 纯 化 ,表 达 的 蛋 白 既 可 存 在 于 胞内 ,又 可 分 泌 至 胞 外 ,如 表 达 的 重 组 水 蛭 素 (HIR) 仅 经 过 两 步 层 析 纯 化 ,纯 度 就 高 达97 %以 上 ; 糖 基 化 程 度 低 ,和 酿 酒 酵 母 相 比 ,甲 醇 酵 母 中 加 到 翻 译 蛋 白 的 糖 链 每 条 长 度 为 814 个 甘 露 糖 残 基 ,较 之 酿 酒 酵 母 (50 150 甘 露 糖 残 基 ) 短 得 多 。 此 外 ,酿 酒 酵 母 核心 多 糖 末 端 存 在 -1 ,3 糖 苷 键 ,使 这 些 蛋 白 具 有 高 度 的 抗 原 性 ,因 而 不 适 宜 作 治 疗制 剂 ,而 甲 醇 酵 母 没 有 。 （ 1） 缺 乏 葡 萄 糖 、 甘 油 时 , 利 用 甲 醇 为 惟 一 碳 源 。（ 2） 甲 醇 在 乙 醇 氧 化 酶 作 用 下 被 氧 化 成 甲 醛 ,在 过 氧 化 物 酶 体 中 氧化 成 H2O2。（ 3） 乙 醇 氧 化 酶 对 氧 的 亲 和 力 很 弱 ,因 此 代 偿 性 地 大 量 产 生 该 酶 ,调控 这 种 酶 的 启 动 子 是 强 启 动 子 ,可 用 来 调 控 异 源 蛋 白 的 表 达 。 两 种 乙醇 氧 化 酶 (即 AOX1 和 AOX2) ,细 胞 中 绝 大 多 数 乙 醇 氧 化 酶 的 活 力 是由 AOX1提 供 。 （ 4） 当 aox1 基 因 缺 失 只 存 在 aox2 时 ,大 部 分 的 乙 醇 氧 化酶 活 力 丧 失 ,细 胞 利 用 甲 醇 能 力 降 低 ,细 胞 在 甲 醇 培 养 基 上生 长 很 慢 ,这 种 菌 株 被 称 为 Muts (Methanol utilization slow) ; aox1 基 因 存 在 时 ,细 胞 利 用 甲 醇 能 力 正 常 ,在 甲 醇 培养 基 上 生 长 较 快 ,这 种 菌 株 表 型 被 称 为 Mut + 。 （ 5） aox1 基 因 的 表 达 为 转 录 水 平 调 控 。 aox1 基 因 的 调控 是 一 个 抑 制 机 制 加 上 诱 导 机 制 的 过 程 ,在 以 葡 萄 糖 或 甘油 为 碳 源 的 培 养 基 上 生 长 时 抑 制 转 录 ,而 在 以 甲 醇 为 惟 一生 长 碳 源 时 诱 导 基 因 转 录 ,蛋 白 质 表 达 。 （ 6)甲 醇 酵 母 生 长 适 宜 温 度 一 般 为 28 30 。 诱 导 期 间如 果 温 度 超 过 32 ,不 利 于 蛋 白 表 达 ,甚 至 会 导 致 细 胞 死 亡 。 主 要 是 可 以 整 合 到 酵 母 基 因 组 中 的 ,其 主 要 元件 包 括 启 动 子 ,信 号 肽 ,多 克 隆 位 点 ,终 止 子 ,选 择 标 志 ,以 及 可 以 诱 导 基因 发 生 重 组 的 同 源 序 列 和 在 大 肠 杆 菌 中 的 复 制 起 点 及 抗 药 性 基 因 。 含 有 AOX1 基 因 序 列 的 表 达 载 体 既 可 以 在 酵 母 基 因 组 位 点 发 生 单 交 换 ,插 入 到 酵 母 基 因 组 中 ;也 可 以 发 生双 交 换 而 取 代 AOX1 基 因 ,相 应 的 表 现 型 分 别 为 Mut + 和Muts。AOX1区 的 整 合 包 括 同 源 双 交 换 引 起 的 基 因 置 换 和 位 点 特异 性 单 交 换 引 起 的 基 因 插 入 。 前 者 使 染 色 体 AOX1基 因 被外 源 基 因 表 达 盒 替 换 ,Mut + 表 型 菌 株 会 转 变 为 MutS 或Mut - ,而 MutS 和 Mut - 菌 株 表 型 不 变 ;后 者 不 改 变 宿 主 原有 的 AOX1 基 因 ,故 各 种 菌 株 的 Mut 表 型 不 变 。 HIS4 区 的整 合 方 式 为 位 点 特 异 性 单 交 换 。 表 达 载 体 向 HIS4 区 或AOX1 区 的 整 合 赋 予 宿 主 菌 野 生 型 组 氨 醇 脱 氢 酶 基 因 ,使其 表 型 由 HIS - 变 为 HIS + ,可 以 此 筛 选 转 化 子 。 (PAOX1)和 。： 受 甲 醇 的 严 格 调 控 ,在 碳 源 为 非 甲 醇 的 条 件下 ,AOX1 基 因 转 录 的 mRNA 检 测 不 到 ,但 在 甲 醇 为 唯 一 碳 源的 培 养 基 中 ,AOX1 基 因 编 码 的 mRNA 可 达 到 总 RNA 的 5 % 。在 PAOX1调 控 下 表 达 外 源 基 因 时 可 通 过 调 节 甲 醇 而 适 时 地控 制 表 达 过 程 ,这 样 可 以 有 效 地 减 轻 选 择 压 力 , 保 证 外 源 基 因的 稳 定 存 在 。： 发 酵 过 程 操 作 简 便 ,可 以 连 续 表 达 ,无 需 诱 导 。 利 用PGAP表 达 外 源 基 因 主 要 的 限 制 是 目 的 蛋 白 不 能 对 宿 主 菌 有毒 性 ,否 则 在 长 期 的 发 酵 过 程 中 将 限 制 其 生 长 。 酿 酒 酵 母 的 ( -mating factor , -MF) 的 信 号 肽 pre-pro或 前 导 部 分 pre： 可 以 介 导 蛋 白 质 沿 分 泌 通 路 分 泌 到 细 胞 外 ,在 分 泌 过 程 中 可 以 被 自 身 的 膜 蛋 白 酶 Kex-2 自 动 切 割 去除 ,Kex-2 的 切 割 位 点 是 其 C 末 端 连 续 两 个 碱 性 氨 基 酸 的 氨 基 端 。可 使 用 外 源 蛋 白 自 身 信 号 肽 ,如 不 能 利 用 自 身 信 号 肽 ,可 选 择 酵母 因 子 的 前 导 序 列 ， 该 序 列 可 非 常 有 效 地 引 导 体 积 稍 小 的 产物 出 胞 。两 种 产 物 形 式 ： 在 因 子 信 号 的 引 导 下 ,通 过 高 尔 基 体 ,分 泌 到胞 外 的 可 溶 性 蛋 白 或 以 包 涵 体 形 式 存 在 。 真 核 生 物 内 许 多 细 胞 因 子 、 淋 巴 因 子 、 酶 、 激 素 等 在 翻 译 后加 工 过 程 中 ,蛋 白 前 体 经 酶 切 变 为 成 熟 蛋 白 时 的 切 割 位 点 也 是在 连 续 两 个 碱 性 氨 基 酸 的 C末 端 ,因 此 用 毕 赤 酵 母 表 达 系 统 可以 对 真 核 蛋 白 进 行 正 确 的 翻 译 后 酶 切 加 工 。位 于 细 胞 膜 上 ， 专 一 性 水 解 因 子 前 体 中 羧 基 端 的 肽键 ， 位 点 为 连 续 两 个 碱 性 氨 基 酸 残 基 ,如 因 子 的 Glu - Lys Arg*Glu - Ala - Glu - Ala( * 表 示 水 解 位 点 ) 。： 识 别 和 水 解 的 是 因 子 的 Glu Ala*Glu - Ala重 复 序列 ,从 而 保 证 了 蛋 白 加 工 过 程 中 的 信 号 肽 的 切 除 。 ： 采 用 氨 基 末 端 间 隔 序 列 解 决 ,在 - 因 子 的 前 导 肽 序 列 和产 物 之 间 加 1 个 间 隔 序 列 ,这 个 间 隔 序 列 肽 可 在 体 外 或 体 内 用 特 异 蛋白 酶 或 酵 母 天 冬 氨 酰 蛋 白 酶 切 除 。酵 母 表 达 基 因 工 程 产 物 时 ,往 往 是 Kex-2蛋 白 酶 除 去 -因 子的 前 导 肽 序 列 常 不 够 完 全 ,导 致 分 泌 蛋 白 有 一 个 过 长 的 氨基 酸 末 端 。在 采 用 pGAPZ作 为 表 达 载 体 时 ,由 于 信 号 肽 加 工 不 完 全 ,可 使 表 达 的 外 源 蛋 白 的 分 子 量 大 小 增 加 9KDa ,但 一 般 不 影响 其 生 物 活 性 。 ： 通 常 所 用 的 酵 母 菌 是 组 氨 酸 脱 氢 酶 缺 陷 型 的(HIS4)菌 株 ,如 GS115、 KM71 ,只 有 转 化 了 含 HIS4 载 体 的 菌 株 才可 以 在 组 氨 酸 缺 陷 的 选 择 性 培 养 基 上 生 长注 意 ： 能 在 选 择 性 培 养 基 中 生 长 的 菌 株 并 不 一 定 含 有 目 的 基 因 , HIS4 + 的 转 化 子 中 约 10 % 50 %根 本 不 含 有 其 它 表 达 载 体 成 分 ,这 主 要 是 因 为 载 体 上 的 HIS4 基 因 与 基 因 组 中 的 his4 位 点 发 生 重组 导 致 回 复 突 变 所 致 ,利 用 电 转 化 时 该 比 例 更 高 。： 含 有 细 菌 卡 那 霉 素 耐 药 基 因 的 载 体 对 抗 生 素 G418 产生 抗 性 。 含 有 Shble 基 因 表 达 产 物 可 以 对 抗 生 素 Zeocin 产 生 抗 性 ,而 且 在 大 肠 杆 菌 与 毕 赤 酵 母 中 均 可 用 作 选 择 标 记 。 ： 含 有 AOX1 和 AOX2 基 因 ,在 含 有 甲 醇 的 培 养 基 中 生 长迅 速 (Mut + ) ; ： AOX1基 因 被 酿 酒 酵 母 的 SARG4 取 代 ,在 甲 醇 中 只 能 使用 AOX2 来 代 谢 甲 醇 ,因 此 生 长 缓 慢 (Muts) ;： AOX1 和 AOX2 基 因 均 被 取 代 ,因 而 在 甲 醇 为 碳 源的 培 养 基 中 不 能 生 长 ,其 表 型 为 Mut-蛋 白 酶 基 因 缺 陷 的 菌 株 ： SMD1163 、 SMD1165 、 SMD1168。蛋 白 酶 缺 陷 型 菌 株 的 活 力 较 差 , 转 化 率 低 且 生 长 缓 慢 , 所 获 外 源目 的 蛋 白 产 量 较 低 。 因 此 , 只 有 在 其 他 降 低 蛋 白 酶 解 方 法 均 不理 想 时 , 才 使 用 蛋 白 酶 缺 陷 型 菌 株 。 转 化 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 的 常 见 方 法 有 四 种 : 、 和 。原 生 质 球 和 电 转 化 法 效 率 较 高 (约 103 104 转 化 子 / gDNA) 。电 转 化 简 单 , 原 生 质 球 方 法 复 杂 。PEG 方 法 和 LiCl 方 法 很 简 单 , 但 这 两 种 方 法 转 化 效 率 较 低 , 且 不易 形 成 多 拷 贝 。 (1) (2) (3) (4) ： 利 用 载 体 和 营 养 缺 陷 型 菌 株 的 互 补 性 或 对抗 生 素 的 抗 性 来 进 行 初 筛 ,复 筛 可 用 PCR 。(5) ： 组 成 型 启 动 子 , 醇 诱 导 型 启 动 子 。(6) ： 表 达 的 条 件 (如 通 气 状 况 ,pH 值 ,培 养 基 的 组成 等 ) ,经 优 化 以 后 就 可 以 按 比 例 放 大 ,从 摇 瓶 培 养 转 至大 规 模 发 酵 。 （ 1） N 糖 基 化 ： 寡 糖 链 与 外 源 蛋 白 肽 链 糖 基 化 识 别 位 点( ) 天 冬 酰 胺 上 的 氮 原 子 (N) 共 价 结 合 ;（ 2） O 糖 基 化 ： 寡 糖 链 与 外 源 蛋 白 肽 链 丝 氨 酸 /苏 氨 酸 上的 羟 基 (OH) 共 价 结 合 。（ 3） 高 等 真 核 细 胞 糖 基 化 寡 糖 链 含 N- 乙 酰 半 乳 糖 胺 、 半 乳糖 和 唾 液 酸 ; 而 低 等 真 核 细 胞 如 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 在 其 分 泌 的 外源 蛋 白 上 所 添 加 的 寡 糖 链 只 含 。（ 4） 有 些 天 然 分 泌 时 不 被 糖 基 化 的 蛋 白 , 由 巴 斯 德 毕 赤 酵 母表 达 时 却 可 能 发 生 糖 基 化 。 如 人 体 内 合 成 的 胰 岛 素 样 生 长 因子 I 为 非 糖 基 化 蛋 白 , 而 由 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 表 达 时 , 却 有 15 % 发 生 了 糖 基 化 作 用 。（ 5） 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 为 其 外 源 蛋 白 添 加 寡 糖 链 时 , 所 选 择 的丝 氨 酸 和 苏 氨 酸 有 时 也 与 天 然 宿 主 细 胞 不 一 致 。 （ 6） 巴 斯 德 酵 母 表 达 的 糖 蛋 白 多 为 8 14 个 甘 露糖 , 产 物 稳 定 ,蛋 白 质 分 子 量 较 接 近 ;而 酿 酒 酵 母 表达 的 糖 蛋 白 甘 露 糖 残 基 多 达 50 150 个 ,蛋 白 质 分 子量 差 异 较 大 。（ 7） 虽 然 糖 基 化 对 某 些 外 源 蛋 白 的 活 性 没 有 太 大影 响 ,但 却 可 能 在 蛋 白 折 叠 和 抗 蛋 白 酶 降 解 中 起 重要 作 用 。（ 8） 从 药 物 应 用 的 观 点 来 看 ,不 合 适 的 糖 基 化 和 寡聚 体 可 能 会 在 机 体 内 产 生 免 疫 反 应 或 毒 副 作 用 , 并且 会 明 显 影 响 纯 化 过 程 中 产 率 的 提 高 。 N - 糖 基 化对 于 很 多 蛋 白 的 正 确 折 叠 、 药 物 动 力 学 的 稳 定 性 和功 效 非 常 重 要 。 （ 3） ： 包 括 异 源 蛋 白 自 身 的 信 号 肽 序 列 ， 酿 酒酵 母 的 -MF分 泌 信 号 肽 序 列 ， 毕 赤 酵 母 的 PHO I (酸 性 磷酸 酶 ) 分 泌 信 号 肽 等 。（ 2） ： 利 于 外 源 蛋 白 的 纯 化 。（ 1） ： 分 泌 蛋 白 可 进 行 翻 译 后 加 工 ,例 如 蛋 白 裂 解 成 熟 、糖 基 化 、 二 硫 键 的 形 成 。 ： 密 码 子 的 偏 爱 性： 酵 母 中 AOX1的 表 达 量 极 高 , 可使 外 源 基 因 mRNA 5UTR 和 AOX1 相 似 或 一 致 。： 含 量 高 ， 偶 尔 会 造 成 转 录 提 前 终 止 ， 对 AT 含 量丰 富 的 基 因 重 新 设 计 序 列 ,使 其 A + T 含 量 在 30 % 55 %范 围内 。 ： 起 始 密 码 子 不 可 处 于 其 周 围 序列 形 成 的 RNA 二 级 结 构 中 。 必 要 的 Kozak 共 有 序 列(ACCAUGG)也 有 助 于 翻 译 的 正 确 起 始 。 在 不 改 变 表 达 载 体 及 宿 主 菌 的 前 提 下 ,通 过 从 Muts 中 分 离 Mut + 自 发 突 变 体 来 使 外 源 蛋 白 的 表 达 量 增 加 。（ 2）宿 主 菌 蛋 白 酶 对 外 源 蛋 白 的 影 响 。转 化 子 的 表 型 对 外 源 蛋 白 的 表 达 有 影 响 ： 蛋 白 胞 内 表 达 时 ,优先 考 虑 用 Muts表 型 ;对 于 分 泌 表 达 ,Mut + 和 Muts 都 可 使 用 。在 高 生 物 量 发 酵 中 ,Mut + 生 长 更 快 ,较 之 Muts对 于 提 高 外 源 蛋白 的 表 达 量 更 有 效 。 有 时 Muts菌 株 虽 然 在 诱 导 阶 段 生 长 缓 慢 ,但 外 源 蛋 白 的 表 达 反 而 更 高 ,更 有 利 于 蛋 白 的 正 确 折 叠 。 在 极 少 数 情 况 下 拷 贝 数 的 增 加 反 而 会 导 致 蛋 白 产 量 的 下 降 。（ 3） 一 般 来 说 ， 外 源 基 因 整 合 的 拷 贝 数 愈 高 ,蛋 白 表 达 量 愈 大 。 并 非 所 有 高 拷 贝 的 转 化 子 都 能 产 生 高 的 表 达 量 ,特 别 在 分 泌表 达 时 ,这 可 能 是 由 于 高 水 平 表 达 阻 断 分 泌 途 径 所 致 。 有 时 有 意 增 加 拷 贝 数 对 表 达 量 并 没 有 什 么 效 果 ： 利 用 甲 醇 诱 导 外 源 蛋 白 表 达 , 在 诱 导 期 间 每 天 应 往 培养 基 中 补 加 甲 醇 ,以 弥 补 甲 醇 的 消 耗 和 蒸 发 ， 一 般 每 天 添 加 到培 养 基 中 的 甲 醇 含 量 为 培 养 基 体 积 0. 5 % 。（ 4） ： 充 足 的 通 气 量 对 于 诱 导 阶 段 外 源 蛋 白 的 表 达 极 其 重 要 。 ： 主 要 对 生 物 量 和 诱 导 表 达 有 影 响 。 ： 培 养 时 间 长 ,也 会 产 生 比 较 大 的 生 物 量 ,在 表 达 某些 蛋 白 时 发 现 ,培 养 时 间 过 长 会 发 生 蛋 白 质 的 过 量 水 解 。 （ 3） ：（ 1） ： 生 物 量 扩 增 阶 段 , 加 少 量 抑 制 物 (通 常 为 甘 油 ) 就 能 满 足 细 胞 快 速 生 长 ,AOX 的 表 达 被 抑 制 ;在 表 达 阶 段 ,只 需 让细 胞 耗 尽 剩 余 的 甘 油 ,然 后 加 入 甲 醇 ,外 源 蛋 白 就 能 得 到 诱 导 表 达 ,这 时 酵 母 生 长 及 其 缓 慢 。 甲 醇 诱 导 后 长 达 150 200h 外 源 蛋 白的 表 达 达 到 高 峰 值 ， 可 获 得 高 产 量 的 重 组 蛋 白 。（ 2） ： 在 扩 增 与 表 达 阶 段 加 入 一 个 过 渡 阶 段 ,在 过 渡期 内 按 生 长 限 制 的 比 例 添 加 甘 油 ,并 在 甲 醇 诱 导 阶 段 加 入 甘 油 。这 种 甲 醇 - 甘 油 共 存 的 方 法 可 使 有 些 表 达 菌 株 更 活 跃 ,合 成 蛋 白更 迅 速 ， 缩 短 表 达 时 间 。 （ 1） 发 酵 周 期 较 长 ,易 污 染 ,且 长 时 间 的 发 酵 不 利 于 外 源蛋 白 的 表 达 ; （ 2） 利 用 易 燃 的 甲 醇 ,表 达 产 物 的 卫 生 安 全 性 需 要 考 虑 ; （ 3） 筛 选 药 物 价 格 昂 贵 也 给 生 产 应 用 带 来 局 限 ; （ 4） 低 表 达 或 不 表 达 的 例 子 也 在 增 多 。（ 5） 分 泌 表 达 的 蛋 白 在 培 养 基 中 被 自 身 分 泌 的 蛋 白 酶 降解 ,由 于 甲 醇 酵 母 多 采 用 高 密 度 发 酵 ， 蛋 白 酶 也 会 随 着 细胞 密 度 的 增 高 而 增 高 。（ 6） 有 些 蛋 白 在 毕 赤 酵 母 中 分 泌 表 达 时 会 发 生 过 度 糖 基化 ,过 度 糖 基 化 会 带 来 一 系 列 问 题 。 利 用 基 因 工 程 去 掉 N-糖 基 化 位 点 。如 何 解 决 酵 母 过 度 糖 基 化 的 问 题 ？ 将 分 泌 性 表 达 改 变 为 细 胞 内 表 达 ; 用 N-糖 苷 酶 或 其 它 酶 去 掉 糖 基 ; 为 什 么 纯 化 后 的 结果 是 质 量 相 近 的 两条 带 而 非 一 条 带 ？ 1、 ：（ 1） 甲 醇 代 谢 与 Pichia pastoris 相 似 ， 有 两 个 乙 醇 氧 化 酶 基因 AUG1 和 AUG2 , 在 甲 醇 代 谢 中 的 作 用 与 毕 赤 酵 母 相 似 。AUG1的 启 动 子 受 甲 醇 专 一 诱 导 且 高 水 平 表 达 , 用 作 调 控 外 源基 因 的 表 达 。（ 2） AUG1 基 因 的 表 达 被 葡 萄 糖 抑 制 ,但 能 被 甲 醇 作 唯 一 碳源 诱 导 迅 速 表 达 ,与 Pichia pastoris 不 同 ,葡 萄 糖 对 AUX1 启 动子 的 阻 遏 ,转 换 为 甲 醇 为 唯 一 碳 源 的 培 养 基 不 能 迅 速 解 除 抑 制 ,因 此 ,可 以 让 Pichia methanolica 在 葡 萄 糖 培 养 基 上 良 好 生 长 ,待 葡 萄 糖 消 耗 完 后 再 用 甲 醇 进 行 诱 导 。 2、 ： 美 国 的 Invitrogen 公 司 推 出 了 两 种 表 达 质 粒pMET、 pMET。（ 1） pMET 用 于 胞 内 表 达（ 2） pMET用 于 分 泌 表 达 ,与 Pichia pastoris 一 样 利 用 酿 酒酵 母 的 - MF 信 号 肽 序 将 表 达 产 物 分 泌 到 胞 外（ 3） 与 Pichia pastoris 不 同 的 是 , 在 转 化 子 中 以 可 产 生 1 - 10 %的 多 拷 贝 重 组 子 ,表 达 质 粒 没 有 卡 那 霉 素 基 因 用 于 筛 选多 拷 贝 重 组 子 ,可 以 通 过 southern 杂 交 来 检 测 重 组 子 的 拷 贝数 。（ 4） 在 转 化 子 中 筛 选 高 产 表 达 菌 株 ,因 为 不 是 拷 贝 数 越 多 表达 量 就 越 高 ,特 别 对 分 泌 表 达 来 说 ,有 时 单 拷 贝 能 获 得 最 高 表达 。 3、（ 1） 两 种 宿 主 菌 ， 为 PMAD11 和 PMAD16 ， 都 是 ADE2(磷酸 核 糖 酰 氨 基 咪 唑 羧 化 酶 )缺 陷 型 。（ 2） PMAD16 是 由 PMAD11 进 一 步 突 变 而 来 ,缺 失 了 蛋 白 酶基 因 ,因 此 MAD16 适 合 于 表 达 对 蛋 白 酶 敏 感 的 外 源 蛋 白 质 ,但在 基 本 培 养 基 上 PMAD16 慢 于 PMAD11。（ 3） PMAD11和 PMAD16 原 始 菌 株 是 粉 红 色 菌 落 ,而 转 化 子为 白 色 ,可 以 通 过 颜 色 的 改 变 筛 选 转 化 子 。（ 4） 表 达 载 体 通 过 同 源 重 组 以 AUG1 作 为 整 合 位 点 将 表 达 质粒 的 外 源 基 因 整 合 到 染 色 体 上 ,转 化 子 的 表 型 可 能 是 Mut + 也可 能 是 Muts ,与 Pichia pastoris 一 样 需 要 鉴 定 转 化 子 表 型 。 （ 3） 汉 逊 酵 母 和 其 它 酵 母 一 样 可 以 分 泌 表 达 , 利 用 高 效 分 泌 表 达 载 体 ,将 水 蛭素 基 因 ( hirudin) 与 MF- 的 信 号 肽 进 行 融 合 ， 表 达 后 能 高 效 分 泌 且 先 导 肽 能被 正 确 切 除 , 在 10L 发 酵 罐 中 的 分 泌 量 可 以 达 到 1g/ L 以 上 。（ 1） 耐 高 温 甲 醇 酵 母 , 只 有 一 个 编 码 甲 醇 氧 化 酶 的 基 因 (MOX) ,其 启 动 子 是强 诱 导 启 动 子 ,与 其 它 醇 氧 化 酶 启 动 子 不 同 ,该 启 动 子 对 葡 萄 糖 的 阻 遏 不 敏 感 ,在 葡 萄 糖 限 制 或 缺 乏 的 条 件 下 ,能 够 被 甲 醇 诱 导 ,因 此 从 培 养 向 诱 导 的 转 换 非常 容 易 ,在 实 际 应 用 中 有 很 大 的 优 越 性 ,其 表 达 量 高 于 其 它 的 酵 母 表 达 系 统 。（ 2） 表 达 系 统 的 整 合 方 式 与 毕 赤 酵 母 不 同 , 毕 赤 酵 母 通 过 同 源 重 组 进 行 整 合 , 得 到 的 重 组 子 90 %以 上 是 单 拷 贝 ,通 过 筛 选 可 以 得 到 多 拷 贝 重 组 菌 ,但 拷 贝 数也 不 是 很 高 。 汉 逊 酵 母 的 表 达 载 体 含 有 宿 主 菌 的 HARS （ tRNA合 成 酶 ） 序 列 ,通 过 自 我 复 制 引 导 外 源 基 因 非 同 源 性 整 合 到 染 色 体 ,50 %以 上 的 重 组 子 是 多拷 贝 ,可 以 获 得 拷 贝 数 为 100 以 上 的 重 组 菌 株 。 表 达 载 体 也 可 以 利 用 rDNA 的重 复 序 列 引 导 外 源 基 因 整 合 到 染 色 体 上 ,从 而 获 得 高 拷 贝 数 的 重 组 菌 。 （ 4） 要 使 多 个 基 因 同 时 在 同 一 个 宿 主 中 表 达 ,可 以 把 多 个 基 因 的 表 达 盒 串 联 在 一 个 表 达 载 体转 化 到 宿 主 表 达 ,这 不 仅 会 增 加 表 达 载 体 的 构 建难 度 ,而 且 基 因 的 表 达 剂 量 多 为 1 1 ,难 以 广 泛应 用 。 由 于 Hansenula polymorpha 能 够 形 成 高 拷贝 数 的 重 组 子 , 就 可 以 把 多 个 基 因 分 别 整 合 到 染色 体 上 共 同 表 达 ,并 筛 选 到 各 基 因 拷 贝 数 合 适 比例 的 重 组 菌 ,使 各 基 因 在 重 组 子 中 按 预 期 的 剂 量表 达 ,形 成 甲 醇 酵 母 代 谢 工 程 菌 ,使 甲 醇 酵 母 细 胞变 成 一 个 生 物 反 应 器 ,从 而 使 甲 醇 酵 母 能 够 高 效合 成 需 要 多 种 酶 才 能 合 成 的 药 物 等 物 质 。 （ 1） Candida 是 酵 母 菌 中 最 大 的 一 个 属 ,有 200 多 个 种 。（ 2） Candida biodini为 多 倍 体 ,碳 源 同 化 能 力 强 ,能 利 用 多 种 碳源 。 由 于 多 倍 体 难 于 获 得 营 养 缺 陷 型 构 建 转 化 系 统 ,限 制Candida biodini 作 为 表 达 系 统 的 应 用 。（ 3） Candida biodinii 中 分 离 到 受 甲 醇 调 控 的 乙 醇 氧 化 酶 基 因(AOD1),随 后 利 用 URA3 作 选 择 标 记 构 建 了 高 效 的 转 化 系 统 ,为Candida biodinii 表 达 系 统 的 应 用 创 造 了 很 好 的 条 件 。（ 4） Candida biodinii 表 达 系 统 是 利 用 乙 醇 氧 化 酶 (AOD1) 的启 动 子 对 外 源 基 因 的 表 达 进 行 调 控 ,葡 萄 糖 抑 制 AOD1 的 表 达 ,用 甘 油 作 碳 源 时 不 抑 制 AOD1 的 表 达 。（ 5） 以 AOD1 为 启 动 子 构 建 酿 酒 酵 母 的 腺 苷 酸 激 酶 的 表 达 质粒 ,并 转 化 Candida biodinoii 得 到 的 重 组 菌 株 中 腺 苷 酸 激 酶 表 达量 占 细 胞 可 溶 性 总 蛋 白 的 22 - 28 %;用 甲 醇 - 甘 油 培 养 基 在 1. 5L 的 摇 瓶 中 培 养 60h ,其 表 达 的 产 量 达 到 2g/ L 以 上 。