资源描述
血 红 蛋 白 2003年 4月 14日 宣 布 人 类 基 因 组 序 列 图 完 成这 标 志 着 进 入 了 后 基 因 组 时 代 。人 类 基 因 组 ： 指 DNA分 子 所 携 带 的 全 部遗 传 信 息 。蛋 白 质 组 ： 生 物 个 体 表 达 的 蛋 白 质 分 子 的总 和 。 主 要 是 对 蛋 白 质 功 能 的 研 究 思 考 1 分 离 生 物 大 分 子 的 基 本 思 路 是 什 么 ？选 用 一 定 的 物 理 或 化 学 的 方 法 分 离 具 有不 同 物 理 或 化 学 性 质 的 生 物 大 分 子 。思 考 2 蛋 白 质 的 分 离 和 提 取 的 原 理 是 什 么 ？根 据 蛋 白 质 各 种 特 性 的 差 异 ， 如 分 子 的形 状 和 大 小 、 所 带 电 荷 的 性 质 和 多 少 、溶 解 度 和 吸 附 的 性 质 和 对 其 他 分 子 的 亲和 力 等 等 ， 可 以 用 来 分 离 不 同 蛋 白 质 。 思 考 3 高 温 灭 菌 和 酒 精 灭 菌 分 别 利 用 蛋 白 质的 何 种 作 用 ， 作 用 结 果 是 什 么 被 破 坏 ？变 性 、 变 性 、 空 间 结 构思 考 4 人 们 用 鸡 的 红 细 胞 提 取 DNA， 用 人(猪 、 牛 、 羊 ） 的 红 细 胞 提 取 血 红 蛋 白 的 原因 是 什 么 ？鸡 的 红 细 胞 具 有 细 胞 核 ， 含 有 DNA，便 于 进 行 DNA的 提 取 ， 人 的 红 细 胞 无细 胞 核 ， 结 构 简 单 ， 血 红 蛋 白 含 量 丰富 便 于 提 取 血 红 蛋 白 。 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 凝 胶 色 谱 法 电 泳 法 缓 冲 溶 液 它 们 在 血 红 蛋 白 的 提 取 中 分 别 起 到 什 么 作 用 。 凝 胶 色 谱 法 分 离 蛋 白 质 的 原 理 电 泳 法 分 离 样 品 的 原 理 缓 冲 溶 液 的 组 成 和 作 用 机 理凝 胶 色 谱 法 的 原 理 和 方 法 样 品 的 处 理 色 谱 柱 填 料 的 处 理 和 色 谱 柱 的 装 填 。 一 、 基 础 知 识 ：（ 一 ） 凝 胶 色 谱 法 （ 分 配 色 谱 法 ） ： 1、 凝 胶 ：一 些 微 小 多 孔 的 球 体 （ 内 含 许 多 贯 穿 的通 道 ， 由 多 糖 类 构 成 如 葡 聚 糖 、 琼 脂 糖 ，具 多 孔 的 凝 胶 就 叫 分 子 筛 ） 2、 概 念 ： 根 据 被 分 离 物 质 的 蛋 白 质 相 对分 子 质 量 的 大 小 ， 利 用 具 有 网 状 结 构 的 凝胶 的 分 子 筛 作 用 ， 来 进 行 分 离 。 3、 原 理 ： 当 不 同 的 蛋 白 质 通 过 凝 胶 时 ，（ ） 的 蛋 白 质 容 易 进 入凝 胶 内 部 的 通 道 ， 路 程 （ ） ， 移 动 速度 （ ） ， 而 （ ）的 蛋 白 质 无 法 进 入 凝 胶 内 部 的 通 道 ， 只 能在 （ ） 移 动 ， 路 程 （ ） ，移 动 速 度 （ ） ， 相 对 分 子 质 量 不 同的 蛋 白 质 因 此 得 以 分 离 。4、 具 体 过 程相 对 分 子 质 量 较 小 较 长较 慢 相 对 分 子 质 量 较 大凝 胶 外 部 较 短较 快 分 子 量 大 小直 径 大 小 大 于 凝 胶 颗 粒 空隙 直 径 ， 被 阻 挡在 颗 粒 的 外 面 小 于 凝 胶 颗 粒 空隙 直 径 ， 可 以 进入 颗 粒 内 部运 动 方 式 垂 直 向 下 移 动 垂 直 向 下 移 动 ，无 规 则 扩 散 进 入颗 粒 内 部运 动 速 度 较 快 较 慢运 动 路 径 较 短 较 长洗 脱 次 序 先 从 凝 胶 柱 洗 脱出 来 后 从 凝 胶 柱 洗 脱出 来 1、 概 念 ： 在 一 定 的 范 围 内 ， 能 对 抗 外来 少 量 强 酸 、 强 碱 或 稍 加 稀 释 不 引 起 溶 液PH 发 生 明 显 变 化 的 作 用 叫 做 缓 冲 作 用 ， 具有 缓 冲 作 用 的 溶 液 叫 做 缓 冲 溶 液 。(二 )缓 冲 溶 液 ： 2、 作 用 ： 能 够 抵 制 （ ） 对 溶 液 的（ ） 的 影 响 ， 维 持 PH 基 本 不 变 。外 界 的 酸 或 碱PH 值 3、 缓 冲 溶 液 的 配 制 通 常 由 （ ） 种 缓 冲 剂 溶 解 于 水中 配 制 而 成 。 调 节 缓 冲 剂 的 （ ）就 可 以 制 得 （ ） 使 用 的缓 冲 液 。 1 2 使 用 比 例在 不 同 PH 范 围 内 思 考 ： 说 出 人 体 血 液 中 缓 冲 对 。 NaH 2PO4 / Na2H PO4H 2CO3 / NaH CO3 （ 三 ） 电 泳 ：1、 概 念 ： 指 带 电 粒 子 在 电 场 作 用 下 发 生 迁 移 的 过 程 。思 考 ： 在 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 实 验 中 用的 缓 冲 液 是 什 么 ？ 它 的 目 的 是 什 么 ？使 用 的 是 磷 酸 缓 冲 液 ， 目 的 是 利 用 缓 冲液 模 拟 细 胞 内 的 PH 环 境 ， 保 证 血 红 蛋 白的 正 常 结 构 和 功 能 ， 便 于 观 察 （ 红 色 ）和 材 料 的 科 学 研 究 （ 活 性 ） 2、 原 理 ： 许 多 重 要 的 生 物 大 分 子 ， 如（ ） 等 都 具 有 ( ) 在 ( )下 ， 这 些 基 团 会 带 上（ ） 。 在 电 场 的 作 用 下 ， 这 些 带电 分 子 会 向 着 与 其 （ ） 移 动 。 电 泳 利 用 了 待 分 离 样 品 中 各 种 分 子（ ） 以 及 分 子 本 身（ ） 、 （ ） 的 不 同 使 带 电 分 子产 生 不 同 的 （ ） ， 从 而 实 现 样 品中 各 种 分 子 的 分 离 。多 肽 、 核 酸 可 解 离 的 基 团正 电 或 负 电 所 带 电 荷 相 反 的 电 极带 电 性 质 的 差 异大 小 形 状迁 移 速 度一 定 的 PH 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 ： 是 由 单 体 丙 烯 酰 胺 和 交联 剂 N,N-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 在 引 发 剂 (过 硫酸 铵 和 催 化 剂 （ 四 甲 基 已 二 胺 ） 的 作 用 下聚 合 交 联 成 三 维 网 状 结 构 的 凝 胶分 类 ：琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳 。测 定 （ ） 通常 用 十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ SDS） 聚 丙 稀酰 胺 凝 胶 电 泳蛋 白 质 相 对 分 子 质 量 二 实 验 操 作蛋 白 质 的 提 取 和 分 离 一 般 分 为 四 步 ：1.样 品 处 理血液 血 浆 水 分固 体 物 质 血 浆 蛋 白无 机 盐磷 脂葡 萄 糖 等血 细 胞 白 细 胞血 小 板红 细 胞（ 最 多 ） 血 红蛋 白 （ ） 两 个 a 肽 链两 个 一 肽 链 样 品 处 理 粗 分 离 纯 化 纯 度 鉴 定共 四 条 肽 链 90 目 的 ： 去 除 （ ）方 法 ： （ ） 离 心 （ 速 度 越高 和 时 间 越 长 会 使 白 细 胞 和 淋 巴 细 胞 等 一同 沉 淀 达 不 到 分 离 的 效 果 ） ， 然 后 用 胶 头吸 管 吸 出 上 层 透 明 的 （ ） ， 将 下层 （ ） 的 红 细 胞 液 体 倒 入 （ ）每 个 肽 链 环 绕 （ ） ， 此基 团 可 携 带 （ ） 。血 红 蛋 白 因 含 有 （ ） 而 呈 红 色 。 本 课题 可 选 用 猪 、 牛 、 羊 或 其 他 脊 椎 动 物 的 血 液 来分 离 血 红 蛋 白 。 一 个 亚 铁 血 红 素 基 团一 分 子 氧 或 一 分 子 二 氧 化 碳血 红 素(1)红 细 胞 的 洗 涤 杂 质 蛋 白低 速 短 时 间 黄 色 血 浆暗 红 色 烧 杯 再加入用 （ ） 的 （ ）即 质 量 分 数 为 0.9 的 氯 化 钠 溶 液 洗 涤 低 速 离 心 （ 低 速 短 时 间 ） 重 复 上 述 步 骤 （ ） 次 ， 直 至 上 清 液中 已 没 有 （ ） ， 表 明 洗 涤 干 净 。 利于 后 续 血 红 蛋 白 的 分 离 纯 化 ， 不 可 洗 涤次 数 过 少 。 五 倍 体 积 生 理 盐 水三黄 色 （ 2） 血 红 蛋 白 的 释 放 加 （ ） 到 （ ） 体 积 ，再 加 40 体 积 的 （ ） （ 溶 解 细 胞膜 ） ， 置 于 （ ） 上 充 分 搅 拌10分 钟 （ 加 速 细 胞 破 裂 ） , 细 胞 破 裂 释 放 出血 红 蛋 白 .(3)分 离 血 红 蛋 白 溶 液 ： 将 搅 拌 好 混 合 液 转移 到 离 心 管 内 ， 以 2000r/min的 速 度 离 心 10 min ， 试 管 中 的 溶 液 分 为 4层 :原 血 液甲 苯磁 力 搅 拌 器蒸 馏 水目 的 ： 使 红 细 胞 破 裂 ， 血 红 蛋 白 释 放 第 1层 （ 最 上 层 ） ： （ ） 甲 苯 层第 2层 （ 中 上 层 ） ： （ ） 的 沉 淀 层 ， （ ） 色 薄 层 固 体第 3层 （ 中 下 层 ） ： （ ） 的 水 溶 液 层 （ ） 的 液 体 第 4层 （ 最 下 层 ） ： 其 它 杂 质 （ ） 的 沉 淀 层无 色 透 明脂 溶 性 物 质白血 红 蛋 白红 色 透 明 暗 红 色 用 滤 纸 过 滤 ，除 去 脂 溶 性 沉淀 层 ， 于 分 液漏 斗 中 静 置 片刻 后 ， 分 出 下层 的 红 色 透 明液 体 。 原 理 ： 课 本 图 解 ， 思 考 ？取 ( )ml的 血 红 蛋 白 溶 液 装 入 （ ）中 ， 将 透 析 袋 放 入 盛 有 300ml的 物 质 的 量浓 度 为 20mmol/L的 （ ） 中 ，pH 为 （ ） ， 透 析 12小 时 ， 目 的 是（ ） 或 用于 更 换 样 品 中 的 （ ） 。 透 析 袋 一般 用 硝 酸 纤 维 素 制 成 ， 又 称 玻 璃 纸 。除 去 样 品 中 分 子 量 较 小 的 杂 质透 析 袋磷 酸 缓 冲 液7.0 缓 冲 液2 粗 提 取 透 析1目 的 ： a.除 去 样 品 中 相 对 分 子 质 量 较 小 的杂 质 b用 于 更 换 样 品 的 缓 冲 液 3.纯 化 凝 胶 色 谱 制 作1） 凝 胶 色 谱 柱 的 制 作 取 长 40厘 米 ， 内 径 1.6厘 米 的 玻 璃管 ， 两 端 需 用 砂 纸 磨 平 。 底 塞 的 制 作 ： 打 孔 挖 出 凹 穴 安 装 移 液 管 头 部 覆 盖 尼 龙 网 ， 再 用 100目 尼 龙 纱 包 好 。 a、 选 择 合 适 的 的 橡 皮 塞 ，中 间 打 孔 ； b、 在 橡 皮 塞 顶 部 切 出 锅 底 状 的（ ） ， 在 0.5ml的 （ ） 头 部切 下 （ ） 长 的 一 段 ， 插 入 橡 皮 塞 孔 内 ，上 部 不 得 超 过 橡 皮 塞 的 凹 穴 底 面 。凹 穴 移 液 管5cm 底 塞 中 插 入 的 玻 璃 管 的 上 部 不 得 超 出 橡 皮塞 的 凹 穴 底 面 ， 否 则 难 以 铺 实 尼 龙 网 ， 还会 导 致 液 体 残 留 ， 蛋 白 质 分 离 不 彻 底 。注 意c.剪 尼 龙 网 小 圆 片 覆 盖 在 （ ）上 ， 用 （ ） 的 尼 龙 纱 将 橡 皮 塞（ ） 包 好 ， 插 到 玻 璃 管 一 端 。d、 色 谱 柱 下 端 用 移 液 头 部 做 （ ） ，连 接 一 细 的 （ ） ， 并 用 螺 旋 夹 控制 尼 龙 管 的 （ ） ， 另 一 端 放入 收 集 （ ） 的 收 集 器 内橡 皮 塞 的 凹 面100目上 部 出 口 部 位尼 龙 管打 开 与 关 闭色 谱 流 出 液 安 装 其 他 附 属 结 构 。顶 塞 的 制 作 ：插 入 安 装 了 玻 璃 管 的 橡 皮 塞组 装 ： 将 上 述 三 者 按 相 应 位 置 组 装 成 一个 整 体。 2） 凝 胶 色 谱 柱 填 料 的 处 理（ 1） 凝 胶 的 选 择 ：（ ） （ G-75） “ G”表 示 凝 胶 的 交 联 程 度 ， 膨 胀 程 度 及 分 离 范 围 。 75表 示 凝 胶 的 得 水 值 ， 即 每 克 凝 胶 膨 胀 时 吸 水 7.5克 。（ 2） 方 法 ： 配 置 凝 胶 悬 浮 液 ： 计 算 并 称 取 一 定 量的 凝 胶 浸 泡 于 （ ） 中 充 分 溶 胀 后 ，配 成 （ ） 。蒸 馏 水凝 胶 悬 浮 液交 联 葡 聚 糖 凝 胶 固 定 ： 将 色 谱 柱 处 置 固 定 在 支 架 上装 填 ： 将 （ ） 一 次 性 的 缓 慢倒 入 （ ） 内 ， 装 填 时 轻 轻 敲 动 色谱 柱 ， 使 凝 胶 填 装 均 匀 。（ 3） 凝 胶 色 谱 柱 的 装 填 方 法凝 胶 悬 浮 液色 谱 柱注 意 ： 凝 胶 装 填 时 尽 量 紧 密 ， 以 降 低 凝 胶颗 粒 之 间 的 空 隙 。 装 填 凝 胶 柱 时 不 能 有 气泡 存 在 ： 因 为 气 泡 会 搅 乱 洗 脱 液 中 蛋 白 质的 洗 脱 次 序 ， 降 低 分 离 效 果 。 洗 涤 平 衡 装 填 完 毕 后 ， 立 即 用 缓 冲 液 洗 脱 瓶 ， 在 ( )高 的 操 作 压 下 ， 用 300ml的 20mmol/l的 磷 酸 缓 冲液 （ pH为 7.0） 充 分 （ ） 12小 时 。 洗 涤 平 衡注 意 液 面 不 要 低 于 凝 胶 表 面 ， 否 则 可 能 有气 泡 混 入 ， 影 响 液 体 在 柱 内 的 流 动 与 最 终生 物 大 分 子 物 质 的 分 离 效 果 。 不 能 发 生 洗脱 液 流 干 ， 露 出 凝 胶 颗 粒 的 现 象 ， 否 则 重新 填 装 。 50cm 3） 样 品 加 入 与 洗 脱加 样 前 打 开 下 端 出 口 ， 使 柱 内 凝胶 面 上 的 （ ） 缓慢 下 降 到 与 （ ）平 齐 ， 关 闭 出 口缓 冲 液凝 胶 面 加 透 析 样 品 调 整 缓 冲 液 面 ： 与 凝 胶 面 平 齐 滴 加 透 析 样 品 ： 用 （ ） 将 1ml（ ）的 样 品 加 到 色 谱 柱 的 （ ） 样 品 渗 入 凝 胶 床 ： （ ） 洗 脱 ： 打 开 下 端 ， 用 磷 酸 缓 冲 液 洗 脱 收 集 ： 待 （ ） 接 近 色 谱 柱 底端 时 ， 用 试 管 收 集 流 出 液 ， 每 （ ）收 集 一 试 管 连 续 收 集注 意 正 确 的 加 样 操 作 ： 不 要 触 及 破 坏 凝 胶 面 贴 壁 加 样 使 吸 管 管 口 沿 管 壁 环 绕 移 动吸 管 透 析 液顶 端样 品 完 全 进 凝 胶 层5ml红 色 的 蛋 白 质 血 红 蛋 白 是 有 色 蛋 白 ， 因 此 在 凝 胶 色 谱分 离 时 可 以 通 过 观 察 颜 色 来 判 断 什 么 时候 应 该 收 集 洗 脱 液 。 这 使 血 红 蛋 白 的 分离 过 程 非 常 直 观 ， 大 大 简 化 了 实 验 操 作 。 思 考 血 红 蛋 白 提 取 和 分 离 的 程 序 可 分 为 四 大 步 ，包 括 ： 样 品 处 理 、 粗 分 离 、 纯 化 和 纯 度 鉴 定 。首 先 通 过 洗 涤 红 细 胞 、 血 红 蛋 白 的 释 放 、 离心 等 操 作 收 集 到 血 红 蛋 白 溶 液 ， 即 样 品 的 处理 ； 再 经 过 透 析 去 除 分 子 量 较 小 的 杂 质 ， 即（ ） ； 然 后 通 过 凝 胶 色 谱 法将 相 对 分 子 质 量 较 大 杂 质 蛋 白 除 去 ， 即 样 品的 （ ） ； 最 后 经 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳进 行 （ ） 。思 考样 品 的 粗 分 离纯 化纯 度 鉴 定 4.纯 度 鉴 定 SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳判 断 （ ） 的 蛋 白 质 是 否 达 到 要 求 ，需 要 进 行 蛋 白 质 的 鉴 定 。纯 化 3.SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 鉴 定 血 红蛋 白 纯 度 (选 做 )血红蛋白的取和分离 凝 胶 色 谱 法 原 理 分 离 过 程凝 胶 电 泳 法缓 冲 溶 液 组 成 作 用蛋 白 质 的提 取 分 离 样 品 处 理 粗 分 离 纯 化纯 度 鉴 定血红蛋白的提取和离 蛋 白 质 分 子 的 差 异 性蛋 白 质 分 子 的 差 异 性凝 胶 色 谱 法 原 理 分 离 过 程凝 胶 电 泳 法凝 胶 色 谱 法 原 理 分 离 过 程凝 胶 电 泳 法缓 冲 溶 液 组 成 作 用缓 冲 溶 液 组 成 作 用蛋 白 质 的提 取 分 离 样 品 处 理 粗 分 离纯 化纯 度 鉴 定蛋 白 质 的提 取 分 离 样 品 处 理 粗 分 离纯 化纯 度 鉴 定 3.SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 鉴 定 血 红蛋 白 纯 度 (选 做 )（ 1） 试 剂 的 配 制丙 烯 酰 胺 和 N, N-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 用 去 离子 水 配 制 29%（ 29 g/100 mL， 下 同 ） 的 丙 烯 酰胺 和 1%的 N, N-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 的 贮 存 液十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ SDS） 用 去 离 子 水 配 成10%的 贮 存 液 ， 于 室 温 保 存 。 用 于 制 备 分 离 胶 和 浓 缩 胶 的 Tris缓 冲 液 TEMED ： 作 用 通 过 催 化 过 硫 酸 铵 形 成 自 由基 而 加 速 丙 烯 酰 胺 与 双 丙 烯 酰 胺 的 聚 合 。 用 去 离 子 水 配 制 10% 过 硫 酸 铵 ： 作 用 提 供 驱动 丙 烯 酰 胺 和 双 丙 烯 酰 胺 聚 合 所 必 需 的 自 由基 。 此 溶 液 须 配 制 新 鲜 液 。Tris甘 氨 酸 电 泳 缓 冲 液 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘 氨 酸 (pH 8.3)， 0.1%的 SDS。 样 品 处 理 液 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)， 100 mmol/L DTT(巯 基 苏 糖 醇 )或 用 5%的 巯 基 乙 醇 ， 2%的 SDS， 0.1%的 溴 酚 蓝 ， 10%的 甘 油 。 染 色 液 0.1%的 考 马 斯 亮 蓝 R250， 40%的 甲醇 ， 10%的 冰 醋 酸 脱 色 液 10%的 甲 醇 和 10%的 冰 醋 酸 。 由 于 制 备 凝 胶 的 丙 烯 酰 胺 和 双 丙 烯 酰 胺 具 有很 强 的 神 经 毒 性 ， 并 且 容 易 被 皮 肤 吸 收 ， 因此 操 作 必 须 在 通 风 橱 内 或 通 风 处 进 行 。TEMED和 过 硫 酸 胺 对 黏 膜 和 上 呼 吸 道 组 织 、眼 睛 、 皮 肤 等 有 很 大 的 破 坏 作 用 ， 吞 服 可 致命 。 因 此 在 进 行 电 泳 操 作 时 一 定 按 照 实 验 要求 和 步 骤 完 成 。 操 作 时 要 戴 好 一 次 性 手 套 。 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 分 离 胶 制 备1)根 据 厂 家 说 明 书 安 装 电 泳 用 的 玻 璃 板2） SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 制 备用 去 离 子 水 4.6 mL， 30%的 丙 烯 酰 胺 2.7 mL，1.5mol、 pH 8.8的 Tris缓 冲 液 2.5 mL， 10%的SDS 0.1 mL， 10%的 过 硫 酸 胺 0.1 mL， TEMED 0.006mL， 混 合 均 匀 ， 迅 速 灌 注 在 两 玻 璃 板 的间 隙 中 间 ， 要 留 出 灌 注 浓 缩 胶 所 需 空 间 (梳 子的 齿 长 再 加 0.5 cm)， 再 在 胶 液 面 上 小 心 注 入一 层 水 （ 约 高 23 mm） ， 以 阻 止 氧 气 进 入 凝胶 溶 液 。（ 2） 电 泳 方 法 步 骤 配 制 SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 浓 缩 胶 溶 液 。用 去 离 子 水 2.7 mL， 30%的 丙 烯 酰 胺 0.67 mL，1.0 mol、 pH 6.8的 Tris缓 冲 液 0.5 mL， 10%的SDS0.041 mL， 10%的 过 硫 酸 胺 0.04 mL， TEMED 0.004 mL， 混 合 均 匀 ， 直 接 灌 注 在 聚 合 的 分 离 胶上 ， 并 立 即 在 浓 缩 胶 溶 液 中 插 入 干 净 的 梳 子 。 整个 操 作 过 程 应 注 意 避 免 气 泡 的 产 生 。 然 后 再 补 加浓 缩 胶 溶 液 ， 使 其 充 满 梳 子 之 间 的 空 隙 ， 将 凝 胶垂 直 放 置 于 室 温 下 聚 合 。 分 离 胶 聚 合 完 全 后 （ 约 30 min） ， 倾 出 覆 盖水 层 ， 再 用 滤 纸 吸 净 残 留 水 。3） 样 品 处 理 5)加 样在 电 泳 样 品 中 按 1 1体 积 比 加 入 样 品 处 理 液 ，在 100 温 度 下 加 热 3 min， 以 使 蛋 白 质 变 性 。 按 顺 序 加 样 ， 加 样 量 通 常 为 1025 L。 样品 可 以 多 加 几 个 ， 例 如 ， 血 浆 样 品 红 细 胞 破 碎 后(即 进 行 凝 胶 色 谱 分 离 之 前 )的 样 品 和 凝 胶 色 谱 分离 之 后 的 样 品4） 浓 缩 胶 聚 合 完 全 后 （ 30 min） ， 小 心 移 出 梳子 。 把 凝 胶 固 定 于 电 泳 装 置 上 ， 上 下 槽 各 加 入Tris甘 氨 酸 电 泳 缓 冲 液 。 必 须 设 法 排 出 凝 胶 底部 两 玻 璃 板 之 间 的 气 泡 。 7） 剥 胶 从 电 泳 装 置 上 卸 下 玻 璃 板 ， 用 刮 刀 撬 开 玻璃 板 。 将 紧 靠 最 左 边 一 孔 （ 第 一 槽 ） 凝 胶 下部 切 去 一 角 ， 以 标 注 凝 胶 的 方 位 。8） 染 色 将 电 泳 凝 胶 片 放 在 考 马 斯 亮 蓝 染 色 液 中 染色 1-2 h。6)电 泳 将 电 泳 装 置 与 电 源 相 接 ， 凝 胶 上 所 加 电 压 为 8 V/cm。 当 染 料 前 沿 进 入 分 离 胶 后 ， 把 电 压 提 高到 15 V/cm， 继 续 电 泳 直 至 溴 酚 蓝 到 达 分 离 胶底 部 上 方 约 1 cm处 ， 关 闭 电 源 。 10)观 察 结 果 ：9)脱 色 ：染 色 完 毕 ， 倾 出 染 色 液 ,换 脱 色 液 脱 色3-10 h， 其 间 需 多 次 更 换 脱 色 液 至 背 景清 楚 。 观 察 你 处 理 的 血 液 样 品 离 心 后 是 否 分 层（ 见 教 科 书 图 5-18） ， 如 果 分 层 不 明 显 ，可 能 是 洗 涤 次 数 少 、 未 能 除 去 血 浆 蛋 白的 原 因 。 此 外 ， 离 心 速 度 过 高 和 时 间 过长 ， 会 使 白 细 胞 和 淋 巴 细 胞 一 同 沉 淀 ，也 得 不 到 纯 净 的 红 细 胞 ， 影 响 后 续 血 红蛋 白 的 提 取 纯 度 。三 实 验 结 果 分 析 与 评 价 由 于 凝 胶 是 一 种 半 透 明 的 介 质 ， 因 此 可以 在 凝 胶 柱 旁 放 一 支 与 凝 胶 柱 垂 直 的 日光 灯 ， 检 查 凝 胶 是 否 装 填 得 均 匀 。 此 外 ，还 可 以 加 入 大 分 子 的 有 色 物 质 ， 例 如 蓝色 葡 聚 糖 2000或 红 色 葡 聚 糖 ， 观 察 色带 移 动 的 情 况 。 如 果 色 带 均 匀 、 狭 窄 、平 整 ， 说 明 凝 胶 色 谱 柱 的 性 能 良 好 。 如果 色 谱 柱 出 现 纹 路 或 是 气 泡 ， 轻 轻 敲 打柱 体 以 消 除 气 泡 ， 消 除 不 了 时 要 重 新 装柱 。 如 果 凝 胶 色 谱 柱 装 填 得 很 成 功 、 分 离 操 作 也正 确 的 话 ， 能 清 楚 地 看 到 血 红 蛋 白 的 红 色 区带 均 匀 、 狭 窄 、 平 整 ， 随 着 洗 脱 液 缓 慢 流 出 ；如 果 红 色 区 带 歪 曲 、 散 乱 、 变 宽 ， 说 明 分 离的 效 果 不 好 ， 这 与 凝 胶 色 谱 柱 的 装 填 有 关 。 讨 论 ： 如 何 测 定 蛋 白 质 的 分 子 量 ？使 用 SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 测 定 蛋 白质 的 分 子 量 时 ， 可 选 用 一 组 已 知 分 子 量 的标 准 蛋 白 同 时 进 行 电 泳 ， 根 据 已 知 分 子 量的 标 准 蛋 白 的 电 泳 区 带 位 置 ， 用 电 泳 迁 移率 和 分 子 量 的 对 数 作 标 准 曲 线 ， 可 以 测 定未 知 蛋 白 质 的 分 子 量 。 市 场 上 有 高 分 子 量 、次 高 分 子 量 及 低 分 子 量 的 标 准 蛋 白 试 剂 出售
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