布鲁氏菌试管凝集试验

布 鲁 氏 菌 血 清 学 检 验山 西 省 疾 病 预 防 控 制 中 心张 秋 香 免 疫 学 基 础 n由 于 布 鲁 氏 菌 培 养 的 营 养 条件 苛 刻 而 且 时 间 长 ， 所 以 布鲁 氏 菌 的 血 清 学 诊 断 越 来 越受 到 重 视 。 主 要 是 根 据 相 应 抗 原 抗 体 可 以在 体 外 发 生 特 异 性 结 合 并 呈 现 可 见反 应 的 原 理 ,用 已 知 抗 原 (或 抗 体 )检测 体 液 中 未 知 的 抗 体 (或 抗 原 ).由 于试 验 时 通 常 是 用 患 者 血 清 作 为 待 检材 料 ,所 以 检 测 抗 原 抗 体 的 体 外 试验 又 称 为 血 清 学 试 验 或 血 清 学 反 应 . n血 清 学 检 查 既 可 协 助 早 期 诊 断 ， 还 可确 定 是 否 复 发 或 重 复 感 染 。n感 染 1-2周 后 ， 患 者 血 清 中 出 现 IgM抗体 ， 可 以 用 凝 集 试 验 或 抗 人 球 蛋 白 试验 检 测 n感 染 周 后 ， 患 者 血 清 中 出 现 IgG抗 体 ，可 以 用 补 体 结 合 试 验 ， 荧 光 抗 体 或ELISA检 测 虎 红 平 板 的 凝 集 反 应 （ RBPT） 原 理n该 试 验 又 称 为 班 氏 孟 加 拉 红 平 板 凝 集试 验 。 由 于 所 用 的 抗 原 是 酸 性（ PH3.63.9） 带 色 的 抗 原 ， 该 抗 原与 被 检 血 清 作 用 时 能 抑 制 血 清 中 的 IgM类 抗 体 的 凝 集 活 性 、 检 查 出 的 抗 体 是IgG类 ， 因 此 提 高 了 该 项 反 应 的 特 异 性 。 器 材 与 试 剂n 虎 红 平 板 凝 集 抗 原 、 被 检 血 清 、 清 洁 脱 脂玻 片 或 有 凹 形 孔 的 玻 片 、 0.1ml吸 管 或 微 量加 样 器 、 混 合 棒 或 牙 签 试 验 方 法n 在 玻 片 上 加 0.03ml被 检 血 清 ， 然 后 加 入 虎红 平 板 抗 原 0.03ml， 充 分 混 匀 ， 在 5分 钟 内观 察 结 果 。 (四 ) 结 果 判 定n 有 二 种 方 法 ， 第 一 种 是 ， 出 现 可 见 的 凝 集 反 应 就 判 为 阳性 ；n 另 一 种 用 “ +”表 示 凝 集 程 度 按 下 列 标 准 用 加 号 记 录 反 应强 度 ：n +： 出 现 大 的 凝 聚 片 或 小 的 粒 状 物 ， 液 体 完 全 透 明 ，100%凝 集n +： 有 明 显 的 凝 聚 片 ， 液 体 几 乎 完 全 透 明 ， 75%凝 集n +： 有 可 见 的 凝 集 片 ， 液 体 不 甚 透 明 ， 50%凝 集n +： 液 体 混 浊 ， 只 有 少 量 粒 状 物 ， 25%凝 集 n -： 液 体 均 匀 混 浊 评 价n 此 法 简 便 、 快 速 、 容 易 操 作 ， 适 于 基 层 大 面 积 检疫 ；n 此 法 有 一 定 敏 感 性 ， 检 查 牛 的 阳 性 率 稍 高 于 绵 羊 、山 羊 。n 因 为 在 酸 性 环 境 下 IgM活 性 受 抑 ， 该 法 主 要 是 检查 IgG类 凝 集 抗 体 ， 所 以 特 异 性 较 好 ， 与 补 体 结 合试 验 、 二 巯 基 乙 醇 （ 2-ME） 试 验 和 抗 球 蛋 白（ Coombs0） 试 验 有 较 高 的 吻 合 率 。n 该 法 受 制 备 抗 原 时 条 件 影 响 较 大 ， 所 以 每 批 制 备抗 原 应 予 以 检 查 、 标 化 方 可 应 用 。 试 管 凝 集 试 验 试 管 凝 集 试 验 的 原 理1897年 莱 特 氏 等 (Wright)与 其 同事 发 现 患 该 病 的 病 人 血 清 与 马 尔他 细 菌 的 培 养 物 产 生 了 凝 集 现 象 ，遂 称 之 为 莱 特 氏 凝 集 反 应 ， 成 了迄 今 常 用 的 血 清 学 诊 断 方 法 之 一 。 设 备 及 试 剂n 试 管 凝 集 抗 原n 被 检 血 清n 0.5%的 石 碳 酸 生 理 盐 水n 吸 管n 试 管n 试 管 架n 孵 箱 操 作 步 骤n 被 检 血 清 的 稀 释 :一 般 情 况 下 ,每 份 血 清 用 5支 小 试管 ,第 一 管 加 入 2.3毫 升 石 碳 酸 生 理 盐 水 ,第 二 管 不加 ， 第 三 、 四 、 五 管 各 加 入 0.5毫 升 .用 1毫 升 吸管 吸 取 被 检 血 清 0.2毫 升 ,加 入 第 一 管 中 ,混 匀 。 混匀 后 , 以 该 吸 管 吸 取 第 一 管 中 血 清 加 入 第 二 和 第三 管 各 0.5毫 升 ， 以 该 吸 管 将 第 三 管 混 匀 ， 并 吸取 0.5毫 升 加 入 第 四 管 ,依 次 稀 释 到 第 五 管 ,混 匀 后从 第 五 管 吸 出 0.5毫 升 弃 去 .如 此 稀 释 后 ,从 第 二 管起 血 清 稀 释 度 分 别 为 1:12.5 1:25 1:50 1:100 操 作 步 骤n 加 入 抗 原 :先 以 0.5%石 碳 酸 生 理 盐 水 将 抗 原 原 液 做适 当 稀 释 （ 一 般 是 作 1:10稀 释 ） ,稀 释 后 的 抗 原 加入 各 稀 释 的 血 清 管 （ 第 一 管 不 加 ， 作 为 血 清 对照 ） ,每 管 0.5毫 升 ,混 匀 。 加 入 抗 原 后 ， 第 二 管 至第 五 管 每 管 总 量 为 1毫 升 ， 从 第 二 管 起 血 清 稀 释 度分 别 为 1:25 1:50 1:100 1:200， 从 第 一 管 再 吸 出0.5毫 升 ， 剩 1毫 升 。n 对 照 管 的 制 作 :n 抗 原 对 照 （ 适 当 稀 释 的 抗 原 加 石 碳 酸 盐 水 ）n 被 检 血 清 对 照n 阴 性 对 照 （ 阴 性 血 清 稀 释 后 加 抗 原 ） n 阳 性 对 照 （ 阳 性 血 清 稀 释 到 原 有 滴 度 加 抗 原 ） n 然 后 将 试 验 管 和 对 照 管 充 分混 匀 后 ， 放 于 37 温 箱 中20-22小 时 后 取 出 ， 在 室 温下 放 置 2个 小 时 ， 以 比 浊 管为 标 准 判 定 结 果 。 结 果 的 判 定n判 定 比 浊 管 的 制 备 :每 次 试 验 须 配 制 比 浊管 作 为 判 定 的 标 准 依 据 .n配 制 方 法 是 :取 本 次 试 验 用 的 抗 原 稀 释 液（ 一 般 1:10） 5-10毫 升 ， 加 入 等 量 的0.5%石 碳 酸 生 理 盐 水 作 倍 比 稀 释 ， 按 下表 配 制 比 浊 管n比 浊 管 的 配 制 试 管 凝 集 反 应 标 准 比 浊 管 配 制n 管 号 抗 原 稀 释 液 （ ml） 生 理 盐 水 （ ml） 透 明 度 标 记n 1 0.00 1.00 100% + n 2 0.25 0.75 75% + n 3 0.50 0.50 50% + n 4 0.75 0.25 25% n 5 1.00 0.00 0% 结 果 记 录n 根 据 各 管 中 上 层 液 体 的 清 亮 程 度 记 录 结 果 ，特 别 是 50%清 亮 度 （ +） 对 判 定 结 果 关 系较 大 ， 一 定 要 与 比 浊 管 对 比 判 定n 血 清 对 照 为 清 亮 透 明 无 沉 淀 ,抗 原 对 照 为 均匀 混 浊 在 两 种 对 照 管 都 成 立 的 情 况 下 ， 才可 判 定 试 验 管 ， 否 则 应 重 做 。 对 沉 淀 需 要经 验 判 定 。 n “+” 几 乎 完 全 凝 集 ， 上 清 液 75%清 亮n “+”显 著 凝 集 ， 上 清 液 50%清 亮n “+” 微 量 凝 集 ， 液 体 25%清 亮n “-” 无 凝 集 ， 液 体 不 清 亮n 确 定 每 份 血 清 滴 度 是 以 出 现 “ +”及 以 上 的凝 集 现 象 的 最 高 血 清 稀 释 度n “+”完 全 凝 集 ， 上 清 液 100%清 亮 诊 断 标 准n 没 有 进 行 过 菌 苗 接 种 的 人 、 畜 血 清 试 验 的 标 准 是 ：n 人 、 牛 、 马 、 鹿 、 骆 驼 等 大 家 畜 血 清 为 1：100( +)及 以 上 者 为 阳 性 ， 1： 50(+)为 可 疑 。n 猪 、 羊 (绵 羊 、 山 羊 )、 犬 等 小 家 畜 血 清 在 1：50(+)及 以 上 者 为 阳 性 ， 1： 25(+)为 可 疑 。n 对 可 疑 反 应 的 人 和 动 物 应 在 10-25天 内 重 复 检 查 ，以 便 进 一 步 确 定 诊 断 。 影 响 试 验 结 果 的 因 素 及 注 意 事 项n 受 检 血 清 应 新 鲜 、 无 溶 血 、 无 污 染 ， 存 放 血 清 处温 度 不 能 超 过 10 ， 采 血 后 应 于 34日 内 进 行 检查 ， 因 放 置 时 间 过 长 可 能 会 导 致 血 清 效 价 降 低 。n 遵 守 操 作 规 程 ： 所 用 的 器 材 要 清 洁 、 干 燥 ， 试 剂的 加 量 一 定 要 正 确 ， 放 入 温 箱 的 温 度 和 时 间 都 要按 要 求 ， 否 则 都 影 响 结 果 。 每 份 血 清 和 抗 原 均 要有 对 照 。n 高 渗 盐 水 作 凝 集 反 应 ， 一 般 浓 度 在 1012%， 一般 切 记 人 血 清 不 能 用 高 渗 盐 水 。 n 作 凝 集 反 应 时 ， 有 个 别 血 清 会 出 现 前 带 现 象 ， 即稀 释 度 低 的 血 清 管 内 (或 血 清 量 多 的 格 )不 发 生 凝集 ， 而 稀 释 度 高 的 管 内 (或 血 清 量 少 的 格 )出 现 凝集 ， 这 叫 做 前 带 现 象 。 如 果 某 血 清 在 平 板 凝 集 反应 中 出 现 了 前 带 现 象 ， 那 么 做 试 管 反 应 时 应 多 做几 个 管 ， 多 采 用 几 个 稀 释 度 。n 氯 化 钠 的 含 量 增 高 对 血 清 反 应 有 明 显 的 影 响 ， 盐的 浓 度 越 高 ， 反 应 的 敏 感 性 提 高 ， 因 此 在 兽 医 界为 了 克 服 凝 集 反 应 中 的 阻 抑 抗 体 的 干 扰 ， 对 羊 血清 采 用 高 渗 盐 水 作 凝 集 反 应 ， 一 般 浓 度 在1012%， 切 记 一 般 人 血 清 不 能 用 高 渗 盐 水 。 n 前 带 现 象 产 生 的 原 因n 胶 体 粒 子 学 说 ： 血 清 稀 释 度 低 所 含 的 胶 体 粒 子多 ， 它 影 响 抗 原 抗 体 的 结 合 ， 而 稀 释 度 高 的 则 含胶 体 粒 子 少 ， 所 以 出 现 凝 集 。n 不 完 全 抗 体 学 说 ： 血 清 中 因 存 在 不 完 全 抗 体 竞争 抗 原 ， 所 以 在 低 稀 释 度 的 管 中 不 凝 集 。n 抗 原 抗 体 比 例 失 调 ， 也 就 是 抗 体 过 剩 或 血 清 内含 有 过 多 防 腐 剂 ， 严 重 污 染 可 造 成 前 带 现 象 的 产生 ， 封 闭 抗 原 的 干 扰 。 评 价n 该 方 法 特 异 性 较 好 ， 敏 感 性 也 高 ， 因 此 适用 于 检 疫 和 临 床 诊 断 。n 由 于 该 试 验 有 时 出 现 前 带 现 象 和 封 闭 现 象 ，所 以 有 时 也 出 现 假 阴 性 结 果 ， 必 要 时 和 其它 方 法 联 合 应 用 。 n抗 原 抗 体 反 应 的 特 点 抗 原 抗 体 结 合 的 特 异 性 抗 原 抗 体 结 合 的 基 础 是 抗 原 决 定 簇 与 抗 体的 抗 原 结 合 部 位 之 间 的 反 应 .这 种 反 应 是 专一 性 的 .例 如 :布 氏 杆 菌 只 能 与 布 氏 杆 菌 抗 体相 结 合 ,而 不 能 与 痢 疾 杆 菌 抗 体 相 结 合 . 抗 原 抗 体 结 合 的 表 面 性n 抗 原 抗 体 的 结 合 仅 仅 是 分 子 表 面 的 结 合 ，虽 然 两 者 的 结 合 相 当 稳 定 ， 但 结 合 后 的 抗原 抗 体 ， 其 本 身 的 结 构 ， 生 物 学 活 性 均 未遭 到 破 坏 ,并 且 在 一 定 条 件 下 可 解 离 .即 抗 原抗 体 的 结 合 是 可 逆 的 ,所 以 ,解 离 抗 原 抗 体 复合 物 的 方 法 可 用 于 提 取 ,纯 化 抗 原 或 抗 体 . 抗 原 抗 体 结 合 的 适 当 比 例抗 原 是 多 价 的 (分 子 表 面 有 多 个 抗 原 决 定 簇 )， 抗 体一 般 是 双 价 的 ， (分 子 的 末 端 有 两 个 抗 原 结 合 部位 )， 所 以 ， 二 者 的 结 合 就 有 一 个 比 例 关 系 问题 只 有 抗 原 抗 体 比 例 适 当 ， 才 能 形 成 较 大 的 ，容 易 观 察 的 复 合 物 如 若 比 例 不 当 ,就 不 能 形 成 较大 复 合 物 .所 以 试 验 时 要 根 据 不 同 情 况 对 抗 原 抗 体(甚 至 两 者 同 时 )进 行 连 续 稀 释 ,以 便 更 好 地 提 供 两者 最 适 的 比 例 .颗 粒 性 抗 原 ,因 其 分 子 较 大 ,形 成 可见 的 凝 集 物 质 所 需 的 抗 体 较 少 ,所 以 试 验 时 一 般 把含 有 抗 体 的 血 清 做 连 续 稀 释 ,尽 管 如 此 ,有 时 还 能在 含 有 较 多 抗 体 的 前 列 试 管 中 ,因 两 者 比 例 不 当 不呈 现 可 见 反 应 ,这 种 现 象 被 称 为 前 带 现 象 . 抗 原 抗 体 结 合 的 阶 段 性抗 原 抗 体 的 结 合 分 为 两 个 阶 段第 一 阶 段 :特 异 性 结 合 阶 段 ,反 应 快 ,只 需 几 秒 或 几 分 即 可 完 成 .但 不 出 现肉 眼 可 见 的 反 应 .第 二 阶 段 :抗 原 抗 体 结 合 的 可 见 阶 段 ,这 一 阶 段 的 反 应 是 可 见 的 ,反 应 较 慢 ,常 需 几 分 钟 ， 几 十 分 钟 或 更 久 。 抗 原 抗 体 反 应 的 影 响 因 素n 电 解 质 ； 抗 原 抗 体 反 应 必 须 有 适 量 的 电 解 质 参 加 ， 否 则 不出 现 可 见 反 应 ， 一 般 拿 0.85化 钠 溶 液 做 为 抗 原 或 抗 体 的 稀释 液 。n 温 度 ： 适 当 提 高 温 度 可 以 增 多 抗 原 与 抗 体 的 碰 撞 机 会 。 促进 反 应 现 象 加 速 出 现 。 一 般 最 适 温 度 范 围 在 0-56之 间 。 在这 个 范 围 内 ， 温 度 低 ， 对 反 应 的 促 进 作 用 较 小 ， 但 生 成 的复 合 物 不 易 解 离 。 温 度 高 ， 对 反 应 的 促 进 作 用 较 大 ， 但 生成 的 复 合 物 容 易 解 离 。 实 际 工 作 中 ， 多 数 反 应 在 37进 行 。在 试 验 过 程 中 ， 一 般 在 加 温 之 前 ， 适 度 的 振 摇 抗 原 抗 体 的混 合 液 ， 也 能 增 加 两 者 之 间 的 碰 撞 机 会 。 n 酸 碱 度 ： 一 般 以 6.0-8.0为 宜 ， 若 低 至 3左 右 ， 因 接 近 细 菌的 等 电 点 ， 可 引 起 细 菌 性 抗 原 非 特 异 性 的 酸 凝 集 ， 影 响 试验 结 果 。 血 清 学 试 验 的 对 照n 由 于 参 加 血 清 学 试 验 的 成 分 和 试 验 过 程 中 可 能出 现 的 影 响 因 素 很 多 ， 所 以 需 要 在 正 式 试 验 的同 时 ， 在 与 正 式 试 验 完 全 一 致 的 条 件 下 分 别 对抗 原 ， 抗 体 等 各 种 成 分 做 对 照 检 查 。 这 些 对 照检 查 和 对 照 试 验 对 观 察 和 分 析 试 验 结 果 是 绝 对必 要 的 。 另 外 ， 诊 断 制 品 一 定 要 在 有 效 期 内 使用 。 谢 谢谢 谢谢 谢