基因工程的基本概念和原理课件

基 因 工 程原 理 方 法 及 应 用蒋 爱 芹 本 课 程 讨 论 4个 问 题 ：1 什 么 是 基 因 工 程 基 因 工 程 的 概 念2 为 什 么 能 进 行 基 因 工 程 基 因 工 程 的 原 理 和 技 术3 怎 样 进 行 基 因 工 程 DNA体 外 重 组 ， 重 组 DNA导入 宿 主 细 胞 后 扩 增 和 表 达4 基 因 工 程 的 应 用 和 前 景 对 于 医 学 来 说 即 生 产 基因 工 程 药 物 和 疫 苗 、 开 展 基 因 治 疗 等 第 一 章 基 因 工 程 的 基 本 概 念D 基 因 工 程 的 基 本 用 途C 基 因 工 程 的 影 响 与 意 义A 基 因 的 概 念B 基 因 工 程 的 诞 生 和 发 展E 基 因 工 程 的 支 撑 技 术 1、 基 因 定 义 的 发 展一 基 因 （ gene)n 19世 纪 中 孟 德 尔 豌 豆 杂 交 试 验 遗 传 因 子 经 典 遗 传 学n 20世 纪 初 摩 尔 根 果 蝇 杂 交 实 验 基 因 连 锁 互 换 基 因 学n 1944年 艾 弗 瑞 肺 炎 双 球 菌 转 化 实 验 遗 传 物 质 DNA分 子 遗 传 学n 1953年 沃 森 -克 瑞 克 DNA双 螺 旋 结 构 分 子 生 物 学 年 G.J.Mendel的 豌 豆 杂 交 试 验 1822-1884 分离定律自由组合定律 摩尔根（18661945）基因连锁互换规律 1953年，DNA双螺旋模型的诞生 肺 炎 双 球 菌 转 化 实 验 爱 弗 莱 证 实 转化 物 质 是 DNA 2、 基 因 的 现 代 定 义基 因 从 化 学 上 来 说 ， 指 的 是 一 段 DNA或 RNA顺 序 ，该 顺 序 可 以 产 生 或 影 响 某 种 表 型 （ genotype， phenotype）， 可 以 由 于 突 变 生 成 等 位 基 因 变 异 体 （ 体 细 胞 父 源 和 母 源 ；正 常 和 突 变 基 因 ） ； 从 遗 传 学 上 来 说 ， 基 因 代 表 一 个 遗 传 单位 ， 一 个 功 能 单 位 ， 一 个 突 变 单 位 。 二 、 基 因 工 程 （ genetic engineering）1、 定 义 将 一 种 生 物 体 （ 供 体 ） 的 基 因 与 载 体 在 体 外 进 行 拼接 重 组 ， 然 后 转 入 另 一 种 生 物 体 （ 受 体 ） 内 ， 使 之 按 照人 们 的 意 愿 稳 定 遗 传 并 表 达 出 新 产 物 或 新 性 状 的 DNA体外 操 作 程 序 ， 也 称 为 分 子 克 隆 技 术 。 因 此 ， 供 体 、 受 体 、 载 体 是 重 组 DNA技 术 的 三 大 基本 元 件 。 基 因 工 程 的 基 本 特 点 是 ， 分 子 水 平 操 作 ， 细 胞水 平 表 达 。 1） 第 一 个 实 现 DNA重 组 的 人 Berg1972年 ， Berg用 E.coR 切 割 SV40DNA和 phageDNA， 经 过连 接 组 成 重 组 的 DNA分 子 。 Berg是 第 一 个 实 现 DNA重 组 的 人2） 第 一 个 取 得 基 因 工 程 成 功 的 人 Cohen1973年 ， Cohen Group将 E.coli的 tetr质 粒 psclol和 nersrR6-3质粒 体 外 限 制 酶 切 割 ， 连 接 成 一 个 新 的 质 粒 ， 转 化 E.coli， 在 含四 环 素 和 新 霉 素 的 平 板 上 筛 选 出 了 terrNer,实 现 了 细 菌 遗 传 性状 的 转 移 。 这 是 基 因 工 程 史 上 的 第 一 个 克 隆 化 并 取 得 成 功 的 例子 ， 这 一 年 被 定 为 基 因 工 程 诞 生 的 元 年2、 基 因 工 程 发 展 史 1972年 ， 美 国 斯 坦 福 大 学 P.Berg等 在 PNAS上 发 表 了 题 为 “ Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972” ， 标 志 着 基 因 工 程 技 术 的 诞 生。 第一个重组体构建 SV40病 毒 是 猿 猴 病 毒， 是 一 种 直 径 为 450的 球 形 病 毒 ， 分 子 量为 28 106道 尔 顿 。SV40的 DNA是 环 状 双链 结 构 ， 全 长 5243个碱 基 对 。 SV40DNA上有 一 个 限 制 性 内 切 酶EcoR 的 切 点 。 当 获 得 二 聚 体 SV40DNA后 ， Berg等 就 证 明 了 环 状DNA被 内 切 酶 切 成 线 性 DNA后 能 够 重 新 环 化 ， 并 且能 够 同 另 外 的 分 子 重 组 。 于 是 他 们 进 行 第 二 步 的 实 验 就 是 从 dvgal DNA中 制 备 含 有 E.coli的 半 乳 糖 操 纵 子 DNA， 用 上 述 同样 的 方 法 进 行 重 组 连 接 ， 并 获 得 成 功 。 第 一 个 有 功 能 重 组 体 的 构 建 虽 然 Berg的 工 作 具 有 划 时 代 的 意 义 ， 但 是 他 们 并 没 有 证明 体 外 重 组 的 DNA分 子 具 有 生 物 学 功 能 。 1973年 ， S.N.Cohen等 在 美 国 PNAS上 发 表 了 题 为“ Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro” （ S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Borer, and R. B. Helling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244, 1973） 的 论 文 ， 宣 布 体 外 构 建 的 细 菌 质粒 能 够 在 细 胞 中 进 行 表 达 ,从 而 完 善 了 Berg开 创 的 基 因 重组 技 术 。 Boyer and Cohen 3） 1976年 美 国 南 旧 金 山 由 博 耶 和 斯 旺 森 建 立 世 界 上 第 一 家遗 传 工 程 公 司 Boyer Swanson 4） 1980年 开 始 建 造 第 一 家 应 用 重 组 DNA技 术生 产 胰 岛 素 的 工 厂 insulinFrom Genetech 5） 1997年 英 国 罗 林 研 究 所 成 功 的 克 隆 了 多 莉 （ 一 ） 理 论 上 的 3大 发 现 ：1） 20世 纪 40年 代 ， Avery发 现 了 生 物 遗 传 物 质 的 化 学 本 质 是DNA。2） 20世 纪 50年 代 ， Watson-crick提 出 了 DNA结 构 的 双 螺 旋 结构 模 型 ， 搞 清 楚 了 生 物 遗 传 物 质 的 分 子 机 制 。3） 20世 纪 60年 代 ， 确 定 了 遗 传 信 息 的 传 递 方 式 ：DNA RNA Pr,破 译 了 全 部 遗 传 密 码 ， 43。3、 基 因 工 程 3大 理 论 , 3大 技 术 准 备 ： （ 二 ） 技 术 上 的 3大 发 明 ：1） “ 基 因 剪 刀 ” 限 制 性 内 切 酶 的 发 明（ 1） 20世 纪 40 60年 代 ， 科 学 家 们 就 为 基 因 工 程 设 计 了 美 好的 蓝 图 ， 但 是 面 对 庞 大 的 dsDNA束 手 无 策 ， 无 从 下 手 把 它 切成 单 个 基 因 片 断 。（ 2） 当 时 的 酶 学 知 识 已 有 相 当 的 发 展 ， 但 是 没 有 一 个 已 发 现的 酶 能 完 成 这 样 的 使 命 。（ 3） 1970年 ， Smith和 Wilcox在 流 感 嗜 血 杆 菌（ Haemophilus inffuenzae） 分 离 纯 化 了 Hind ， 取 得 了 突 破 ，为 基 因 工 程 奠 定 了 最 为 重 要 的 技 术 基 础 。 1970年 ， 从 流 感 嗜 血 杆 菌 中 分 离 到 一 种 限 制 性 酶 Hamilton O. Smith美国霍普金斯大学医学院1931年- Daniel Nathans美国霍普金斯大学医学院1928年-1999年Werner Arber 瑞士Biozentrum大學1929年- 1978年诺贝尔奖Smith HO, Wilcox KW. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J Mol Biol. 1970;51(2):379-91 2） 载 体 (“ 交 通 工 具 车 子 ” ) 基 因 工 程 技 术 诞 生 的 第 二 个 技术 准 备（ 1） 有 了 切 割 与 缝 合 （ ligase） 基 因 DNA的 工 具 ， 还 得 有 一个 车 子 将 重 组 DNA送 到 宿 主 细 胞 中 去 。（ 2） 1946年 起 ， Lederberg就 研 究 细 菌 性 因 子 （ F因 子 ） ，50-60年 代 相 继 发 现 了 R因 子 （ 抗 药 因 子 ） ， CoE(大 肠 杆 菌 因子 )等 质 粒 。（ 3） 然 而 ， 直 到 1973年 Cohen才 能 将 质 粒 作 为 基 因 工 程 载 体使 用 （ 至 今 一 直 是 基 因 工 程 最 重 要 最 广 泛 使 用 的 载 体 ） 。 这是 基 因 工 程 的 第 二 个 技 术 准 备 。 3） 逆 转 录 酶 1970年 Baltimove和 Temin等 同 时 各 自 发 现 了逆 转 录 酶 ， 打 破 了 遗 传 学 （ 生 物 学 ） 中 心 法 则 ， 使 真 核 基因 的 制 备 成 为 可 能 。 （ 原 因 如 下 ）（ 1） 真 核 基 因 组 庞 大 而 复 杂 ， 不 易 制 得 基 因 图 谱 。（ 2） 即 使 有 了 基 因 图 谱 ， 因 为 真 核 基 因 有 内 含 子 ， 不 能 在原 核 表 达 系 统 剪 接 出 mRNA， 没 有 成 熟 的 mRNA就 不 能 得 到相 应 的 产 物 。（ 3） 经 过 逆 转 mRNA cDNA(complementory DNA)文 库要 比 基 因 组 文 库 小 得 多 ， 所 以 筛 选 阳 性 克 隆 就 方 便 得 多 。 4、 基 因 工 程 相 关 的 概 念 ：（ 一 ） 克 隆 （ clone,cloning）（ 1） 作 为 名 词 基 因 型 （ genetype） 相 同 的 细 胞 或 生 物 体 的 一 个 群 体 ， 通 过 无 性 繁殖 获 得 。 带 有 相 同 插 入 顺 序 的 重 组 DNA分 子 的 1个 群 体 ， 如 描 述 一 个 微 生 物菌 落 ， 这 些 微 生 物 带 有 共 同 的 插 入 了 特 定 DNA片 断 的 载 体 分 子 。（ 2） 作 为 动 词 ， 即 利 用 体 外 DNA重 组 技 术 将 一 个 特 定 的 基 因 或 DNA顺 序 插 入 一 个 载 体 分 子 。 由 于 整 个 操 作 在 分 子 水 平 上 进 行 ， 所 以 称 为分 子 克 隆 （ molecular cloning） 。 （ 二 ） 重 组 DNA技 术 (DNA recombination technique)是 用 酶 学 的 方 法 将 不 同 来 源 的 DNA在 体 外 切 割 ， 连 接 组 成 一个 杂 合 的 DNA分 子 的 技 术 。 DNA重 组 技 术 是 基 因 工 程 的 核 心内 容 。（ 三 ） 生 物 工 程 （ Biologic engineering） ： 是 更 大 范 围 内 生 产产 品 的 工 程 技 术 ， 是 现 代 生 物 学 中 一 切 工 程 技 术 的 总 称 ， 包括 ： 基 因 工 程 、 酶 工 程 、 细 胞 工 程 、 微 生 物 工 程 、 发 酵 工 程等 。 三 基 因 工 程 的 意 义 人 类 对 自 然 的 干 预（ 一 ） 遗 传 和 变 异 是 生 物 学 的 一 对 重 要 概 念 。1.遗 传 赋 予 生 物 种 的 稳 定 ， 保 证 生 物 种 的 延 绵 不 断 。2. 变 异 赋 予 生 物 种 的 进 化 ， 保 证 生 物 种 对 环 境 的 适 应 。3. 遗 传 和 变 异 这 一 对 矛 盾 在 一 个 生 物 体 内 统 一 起 来 。4.在 生 物 演 变 的 历 史 长 河 中 ， 自 然 发 生 的 变 异 是 相 当 相 当 缓 慢 的 。5.随 着 生 物 科 学 的 发 展 ， 尤 其 是 基 因 工 程 技 术 的 诞 生 ， 人 类 开 始 干 预 生物 的 变 异 （ 福 耶 祸 耶 ？ 无 法 定 论 ）6.经 典 的 遗 传 学 千 百 万 年 才 能 积 累 出 现 的 有 利 的 变 异 ， 通 过 基 因 工 程 手段 几 十 年 乃 至 几 年 就 可 以 实 现 。 Hello DollyDolly was the first mammal cloned from an adult cell.She was born in 1997 and died in 2003.She was 6 when she died, about half the usual age for a sheep 是2010年5月20日美国科学家向世界宣布的、首例人造生命完全由人造基因控制的单细胞细菌诞生，并将它命名为“人造儿”。意义：新的生命体可以在实验室里“被创造”，而不是一定要通过“进化”来完成人造活细菌的细胞核 (二 )多 利1997 2 23 ， Nature杂 志 报 道 ， 英 国 爱 丁 斯 堡 罗 斯 林 研究 所 和 PPL生 物 技 术 公 司 已 经 成 功 克 隆 了 一 只 名 叫 多 利 的 绵羊 （ 1997 2003/7/12） 。为 什 么 以 前 胚 胎 克 隆 没 有 在 世 界 上 引 起 轩 然 大 波 呢 ?它 推 翻 了 遗 传 学 上 一 条 上 百 年 的 定 律 ： 体 细 胞 功 能 高 度 分 化 ，不 可 能 重 新 发 育 成 个 体 。 （ 三 ） 多 利 诞 生 的 过 程1.取 出 第 一 只 成 年 母 羊 乳 腺 的 普 通 细 胞 ， 分 离 基 因 备 用 。2.取 出 第 二 只 母 羊 未 受 精 的 卵 细 胞 ， 取 出 细 胞 核 换 上 第 一 只 羊乳 腺 细 胞 核 （ “ 掉 包 ” ） ， 放 电 激 活 该 卵 细 胞 ， 使 之 象 正 常 受精 卵 一 样 进 行 细 胞 分 裂 ， 直 至 一 定 阶 段 ， 胚 胎 成 熟 。3.将 成 熟 的 胚 胎 移 植 到 第 三 只 母 羊 子 宫 中 发 育 ， 妊 娠 （ 同 正 常一 样 ） ， 最 后 产 下 多 利 。这 样 一 只 与 第 一 只 羊 基 因 百 分 之 百 一 样 的 复 制 品 诞 生 了 。 （ 四 ） 此 克 隆 非 彼 克 隆（ 五 ） 克 隆 是 一 把 双 刃 剑克 隆 对 人 类 社 会 伦 理 道 德 提 出 了 一 场 非 同 寻 常 的 挑 战 四 基 因 工 程 的 基 本 用 途基 因 工 程 药 物转 基 因 植 物转 基 因 动 物基 因 治 疗基 因 芯 片 技 术 Bacteria can be engineered to “eat” oil spills. 转基因植物 转基因动物 Human DNA in a Goat Cell This goat contains a human gene that codes for a blood clotting agent. The blood clotting agent can be harvested in the goats milk.Transgenic Goat 五 基 因 工 程 的 基 本 形 式第 一 代 基 因 工 程 蛋 白 多 肽 基 因 的 高 效 表 达 经 典 基 因 工 程第 二 代 基 因 工 程 蛋 白 编 码 基 因 的 定 向 诱 变 蛋 白 质 工 程第 三 代 基 因 工 程 代 谢 信 息 途 径 的 修 饰 重 构 途 径 工 程 第 四 代 基 因 工 程 基 因 组 或 染 色 体 的 转 移 基 因 组 工 程 第 二 代 基 因 工 程 （ 蛋 白 质 工 程 ）以 蛋 白 质 结 构 功 能 关 系 的 知 识 为 基 础 ， 通 过 周 密 的 分子 设 计 ， 把 蛋 白 质 改 造 为 人 类 合 乎 需 要 的 新 的 突 变 蛋白 质 。 第 三 代 基 因 工 程 （ 途 径 工 程 ） 借 助 DNA重 组 技 术 优 化 细 胞 的 酶 活 性 、 运 转 及调 控 功 能 ， 从 而 改 变 细 胞 的 特 性 。 第 四 代 基 因 工 程 （ 人 类 基 因 组 计 划 ） 于 20世 纪 80年 代 提 出 的 ， 由 国 际 合 作 组 织 包 括 有 美 、 英 、 日 、 中、 德 、 法 等 国 参 加 进 行 了 人 体 基 因 作 图 ， 测 定 人 体 23对 染 色 体 由3 109核 苷 酸 组 成 的 全 部 DNA序 列 ， 于 2000年 完 成 了 人 类 基 因 组 “工 作 框 架 图 ” 。 2001年 公 布 了 人 类 基 因 组 图 谱 及 初 步 分 析 结 果 。 其 研究 内 容 还 包 括 创 建 计 算 机 分 析 管 理 系 统 ， 检 验 相 关 的 伦 理 、 法 律 及 社会 问 题 ， 进 而 通 过 转 录 物 组 学 和 蛋 白 质 组 学 等 相 关 技 术 对 基 因 表 达 谱、 基 因 突 变 进 行 分 析 ， 可 获 得 与 疾 病 相 关 基 因 的 信 息 。 六 基 因 工 程 的 支 撑 技 术凝 胶 电 泳 技 术分 子 杂 交 技 术细 菌 转 化 转 染 技 术DNA序 列 分 析 技 术聚 合 酶 链 反 应 （ PCR） 技 术