酶学分析技术2016

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,第五章,酶学分析技术,1,2,简介内容：,一、酶的基础知识,二、酶含量的表示方法,三、酶促反应动力学,四、酶促反应进程,第一节酶学分析技术基本知识,3,一、酶的基础知识,4,高效性、高度特异性、高度不稳定性、可调节性,酶的应用：,酶（,enzyme,）,：,由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂,酶的催化特点：,酶活性,/,含量的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临床诊断和疗效判断。,酶的组成和命名,由于酶的特异性强，催化反应的速度快，反应条件温和等，因此酶试剂一般化学试剂，具有更高的特异性和灵敏度，更易于自动化，可为临床更加及时地提供准确的检验信息。,胰,蛋白,水解,酶,5,二、酶含量的表示方法,酶测定标本及方法类型,标本：,组织细胞,体液：以血浆或血清为主,测定方法：,酶质量测定：绝对质量，以g/L为表示单位,酶活性测定,：相对质量，以U/L为表示单位,7,(,一,),、酶活性浓度表示方法,酶活性,（,enzyme activity,）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内,产物的生成量,或底物的减少量。,表示方法：,或,式中,v,：反应速率，,P ,：产物浓度，,t,：时间，,S,：底物浓度。,8,酶活性单位,定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，,单位时间内,生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的,酶量,。,表示方法：,惯用单位,（一定的反应量,/,一定的反应时间）,国际单位,IU,（,mol/min,）,Katal,单位（,mol/s,）,9,1,惯用单位：,20,世纪,60,年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位,ALP,的金氏单位（,King,）,氨基移转酶的卡门氏单位（,Karmen,）,特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。,卡门氏单位：,1.0ml,血清在,25,，,340nm,，反应体积,3.0ml,光径,1.0cm,时每分钟测定吸光度下降,0.001,，即消耗,4.82,10,-4mol NADH,为一个卡门氏单位,举例：,金氏单位：,100ml,血清,ALP,在,37,与底物作用,15min,，产生,1mg,酚。,10,2.,国际单位,IU,（,mol/min,）,定义：在规定条件下（,25,及其他最适条件），每,min,催化,1,mol,底物转变为产物的酶量，为,1IU,或,1U,，,1IU=1,mol/min,。,IFCC,2001,年,37,3,Katal,单位,定义：,1Katal,是在规定条件下，每,秒,钟催化,1mol,底物转变为产物的,酶量。,1Katal,1mol/s,。,IU,与,Katal,单位的关系：,1katal = 6010,6,IU,，,1IU = 16.67nkatal,国际单位,IU,25,单位,U,37,11,酶活性浓度,酶活性浓度指,单位体积样本中的酶活性单位,。,国际单位用,IU/L,或,U/L,表示,。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性,.,计算公式,:,产物的增加量 每单位规定的保温时间,1000,（,ml,）,酶单位,/,升,=,每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（,ml,）,分光光度法测定的公式：,（,A,测定,A,对照）,V,总,10,6,每单位规定的保温时间,酶单位,/,升,=,L,V,标 实际保温时间,正常上限升高倍数（ULN）,概念,：某标本酶活性测得的结果除以该法正常参考范围上限所得倍数。,即,ULN,酶活性实测值,正常参考范围上限,例,：如某人血,ALT,测定结果为,80u/L,，该测定方法正常参考范围上限为,40,mmol/L,，,其,ULN,80/40,2,原理,：,用免疫学技术直接测定酶的质量，以质量浓度单位报告结果。如ng/ml或,g/L等。,优点,：,1、灵敏度高；,2、特异性高,3、无活性酶蛋白测定,4、适于同工酶测定,不足,：,1、抗体难以制备；2、方法繁杂；3、测定成本高,(,二,),、酶质量浓度表示方法,15,三、酶促反应动力学,16,研究内容：,(,初速度,单因素,),研究,酶促反应的速率,及其,各种,影响因素,（如底物浓度、酶活性浓度、温度、,pH,、激活剂和抑制剂等）的科学 。,指导,选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最,适,pH,、激活剂和抑制剂类型与含量,等，从而准确测定酶活性,或代谢物浓度。,研究意义,:,(,一,),、酶促反应机制,E + S,ES E + P,米,-,曼氏方程,(,数学表达式,),v = ,v,代表反应速度,Vmax,代表最大反应速度,S,代表底物浓度,Km,米氏常数,Km,值是酶的特征常数,，具有重要的应用价值。,VmaxS,S+ Km,19,K,m,的含义,:,当,K,m,=S,时， ，可见,K,m,值等于反应速率达,到最大反应速率,V,max,一半时的底物浓度。,Km,的意义：,Km,是酶的一个,特征性常数,（其他如等电点），,Km,的大小只与酶的性质有关,鉴别,酶的种类,反映,酶对底物亲和力,的大小,选择酶的,最适底物,或天然底物,设计适宜的底物浓度,20,Vmax,的含义,定义：,Vmax,表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。,应用：计算酶的转换数（,TN,，催化常数,Kcat,）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。,计算公式为：,(,单位是,s,-1,),计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）,TN =,底物转化量（,mol/s,）,/,酶量（,mol,）,=,Vmax,/,E,（二）、,Km,与,Vmax,的应用,2.,鉴定酶的种类,Km,值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与,酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。,不同种,类的酶其,Km,值不同，对于一种未知的酶，可在规定的,条件下测定其,Km,值加以鉴定。,1. Km,的计算,表,.,某些酶的,Km,值,酶,底物,Km(mmol/L),乳酸脱氢酶 丙酮酸,0.017,己糖激酶,D-,葡萄糖,0.05,D-,果糖,1.5,-,半乳糖苷酶,D-,乳糖,4.0,碳酸酐酶,H2CO3 9.0,过氧化氢酶,H2O2 25,蔗糖酶 蔗糖,28,糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸,108,3.,反映酶与底物的亲合力,Km,值越大，酶与底物亲合力越小，,Km,值越小，酶与底物亲合力越大。,4.,选择酶的最适底物,当酶可有几种底物时，其,Km,值最小者，为该酶的最适底物。,酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物,。,5.,设计适宜的底物浓度,酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的,92%,左右，当,S,在,10,20km,是，反应初速度可达,90%,95%Vmax,。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。,6.,Vmax,可用于酶的转化率的计算,25,四、酶促反应进程,26,以,产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标,作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线）,t,1,t,2,时间,t,图,5-1,酶促反应进程曲线,吸光度,A,延滞期,线性期,非线性期,27,（一）延滞期,（,lag phase,、延迟期,）,特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟,t,1,t,2,时间,t,图,5-1,酶促反应进程曲线,吸光度,A,线性期,非线性期,R1,R2,延滞期,孵育期,延滞期,28,（二）线性期,特点：可代表酶促反应速度,最大反应速度期，是,测 定酶活性最佳时期,，持续时间15min。此期反应速度与底物浓度无关，而与酶活性成正比。,线性期,（,零级反应期,）：,概念：酶促反应速度达到最大并保持恒定速度进行反应的时期,29,（三）非线性期,（,偏离线性期、平坦期,）,进入非线性期的原因：,反应的不断进行，,底物消耗越来越多，可逆反应增强、产物抑制增加,等使得反应速率明显下降。,特点：,若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度,S,的一次方,成正比，为,一级反应,。,30,酶学分析技术的应用,第二节 酶活性测定方法,第三节 代谢物酶学分析技术,31,酶测定,绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法,相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法,E,E,第二节 酶活性测定方法,32,一、定时法,原理：,定时法是固定时间法的简称，是指底物与酶反应一段时间（,t1,t2,）后,加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应,测定这段时间内产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。,特点：,优点：,简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。,缺点：,如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（,t1-t2,）是否为零级反应,，故难以确保测定结果的准确性。,吸光度,A,t,1,t,2,时间,t,图,5-6,定时法的三种反应进程,2,3,1,二、连续监测法,原理：,连续监测法是指在酶促反应的,线性期,每间隔一定时间测定一次产物或底物的变化量,根据其变化量间接求出酶活性浓度，因是测定产物或底物随时间的变化量又称速率法。,概 念,与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，,很容易找到呈直线的线性期,，检查到是否偏离零级反应；,标本和试剂用量少，可在短时间内完成测定；,连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，在测定原理上，,可以选择紫外吸收法或,生色原显色法；,要求能够准确地控制温度、,pH,值和底物浓度等,，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求 。,特 点,无需停止酶促反应,不需添加其他呈色试剂,在线性期测定酶活性,标本和试剂用量少,可在短时间内完成测定,连续观测反应进程,对仪器要求高,（一）直接法,指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶活性的方法。,测定,NAD,（,P,）,H,的方法,测定人工合成的色素原底物的方法,测定耗氧量的方法,测定,pH,改变的方法 等,连续监测法的分类,1,测定,NAD,（,P,）,H,的方法,原理：,监测,340nm,吸光度的变化可以反映,NAD,（,P,）,H,量的变化，其变化与待测酶的含量正相关。,对象：,以,NAD,（,P,）,+,或,NAD,（,P,）,H,为辅酶的脱氢酶类,。例如,LD,、,G-6-PD,、,GLDH,等 。,38,人工合成的色素原底物,待测酶,产物的毫摩尔吸光系数,对硝基苯酚磷酸二钠盐（,PNPP-Na,2,）,ALP,对硝基酚（,PNP,）（,405nm,，,pH10.3,）,18.5,L-,谷氨酰,-3-,羧基对硝基苯胺,GGT,2-,硝基,-5-,氨基苯甲酸,（,405nm,，,pH8.1,）,9.49,2-,氯,-,硝基酚,-,半乳糖,-,麦芽糖苷,AMS,2-,氯酚（,2-CP,）（,405nm,，,pH6.0,）,6.1,2-,氯,-,硝基酚,-,岩藻糖苷,-,岩藻糖苷酶（,AFU,）,2-CP,（,405nm,，,pH6.5,）,6.2,2,测定人工合成的色素原底物的方法,原理：,一些水解酶类或转移酶类通过酶促反应后，其化合物中的某一基团被水解或转移，使,无色的底物转变为有色的产物，这类底物称为色素原底物。,根据这一原理，可以人为地合成一系列底物即人工合成的色素原底物后测定酶活性。,底物和测定对象：,39,（二）间接法,一步间接法,酶偶联法,是指加入相应试剂后,间接测定酶促反应的产物转化物或,底物转化物的理化指标,以测定酶活性的方法。,在反应体系中,加入一些与酶促反应无关同时也不影响酶活性的试剂，,这些试剂只和酶反应物（一般是产物）迅速作用，产生信号变化,（三）酶活性浓度的计算,摩尔消光系数,(,),：在特定条件下，当吸光物质的浓度为,1 mol/L,，吸收池厚为,1cm,，以一定波长的光通过时，所引起的吸光度值,A,。,意义：,值取决于入射光的波长和吸光物质的吸光特性，亦受溶剂和温度的影响。显然，显色反应产物的,值愈大，基于该显色反应的光度测定法的灵敏度就愈高。,在测酶时，常数,K,值的选择是很重要的。此值过高虽然测定的线性范围较宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但线性窄。改变,K,值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍数愈大，,K,值愈大,41,代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物浓度的技术。,酶法分析（,enzymatic method,）是以,酶为试剂,测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。,第三节 代谢物酶法分析技术,42,在代谢物酶学分析技术中，分光光度法仍是最常用的检测方法。根据测定方法的原理不同，一般将其分为单酶反应、酶偶联反应、酶循环反应等。,酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序；,试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染；,酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。,代谢物酶法分析主要优点,代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法,代谢物酶法分析的方法,43,待测物与产物在理化性质上有便于检测的信号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为直接法。,一、单酶反应测定技术,44,尿酸,+ O,2,+ H,2,O,尿囊素,+ CO,2,+ H,2,O,2,胆绿素,+ H,2,O,胆红素,+ O,2,尿酸在,293 nm,处有吸收，而尿囊素没有吸收，在,293 nm,处测定吸光度下降,胆红素在,450nm,处有吸收，而胆绿素没有吸收，在,450nm,处测定吸光度下降,尿酸紫外法测定,胆红素测定,45,在,340 nm,处测定吸光度的,增加来进行定量的方法,乳酸测定,乳酸,+ NAD,+,丙酮酸,+ NADH + H,+,丙酮酸测定,在,340 nm,处测定吸,光度的下降来进行定量的方法,乳酸,+ NAD,+,丙酮酸,+ NADH + H,+,46,酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。,二、酶偶联反应测定技术,名 称 缩写符号 名 称 缩写符号,乳酸脱氢酶,LDH,苹果酸脱氢酶,MDH,6-,磷酸葡萄糖脱氢酶,G6PD,谷氨酸脱氢酶,GLDH,葡萄糖氧化酶,GOD,胆固醇氧化酶,COD,磷酸甘油氧化酶,GPO,过氧化物酶,POD,己糖激酶,HK,肌酸激酶,CK,丙酮酸激酶,PK,甘油激酶,GK,脂蛋白脂肪酶,LPL,胆固醇酯酶,CE,脲酶,肌酐酶,(,一,),工具酶,工具酶：,将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。,（二）酶偶联反应的原理,在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的,Km,和,Vmax,等动力学因数加以计算确定。,1,、酶偶联反应测定酶活性的原理,2,、酶偶联反应测定代谢物浓度的原理,（三）常用的偶联指示系统,1,脱氢酶指示系统,用作工具酶的脱氢酶都是以,NAD(P)H,为辅酶的脱氢酶，例如,LDH,、,MDH,、,G6PD,、,GLDH,等，它们催化下列反应：,P + NAD(P)H + H,+,PH,2,+ NAD(P),+,可对,NAD(P)H,在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定,应用：,ALT,、,AST,、,CK,等酶活性测定。,50,以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶,(,NAD,+,),或氧化型辅酶,(,NADP,+,),变为还原型,NAD(P)H,后在,340 nm,处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型,NAD,(,P,),H,变为氧化型,NAD,(,P,),+,，测定,340 nm,处吸光度的下降来计算被测物的浓度。,血清葡萄糖己糖激酶法测定,Glu + ATP,G-6-P+ADP,G-6-P +,NADP,+,P-6-G,A,+,NADPH + H,+,指示酶反应将,NADP,+,转化为,NADPH + H,+,，测定,340 nm,吸光度上升的,速度与葡萄糖的含量成正比,血清尿素测定,尿素,+ H,2,O,2NH,3,+ CO,2,NH,3,+ -,酮戊二酸,+ NADH + H,+,谷氨酸,+ H,2,O + NAD,+,测定,340nm,吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定,2,过氧化物酶,(POD),指示系统,POD,可,催化,H,2,O,2,与某些色原反应，例如与,4-,氨基安替比林（,4-AAP,）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：,POD,2H,2,O,2,+ 4-AAP +,酚 醌亚胺（红色）,+ 4H,2,O,Trinder,反应,：,应用,：,GOD,、,COD,、,GPO,、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与,POD,偶联，通过,Trinder,反应加以测定。,最大吸收峰为,500nm,，在可见光范围内比色。已广泛用于,葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯,等项目的测定,胆固醇酯,+ H,2,O,胆固醇,+ O,2,胆固醇,+,脂肪酸,4,-,胆甾烯酮,+ H,2,O,2,红色醌类化合物,H,2,O,2,+ 4-AAP +,酚,血清总胆固醇氧化酶测定法,缺点：容易受还原性物质（维生素,C,、尿酸、胆红素、,GSH,等）的干扰而影响结果的准确性,消除方法：双试剂法,优点：在可见光范围测定，便于推广应用；对酶的纯度要求不高，生产方便，价格低；灵敏度高于脱氢酶系统,Trinder,反应,55,化学名,英文缩写,最大吸收峰（,nm,）,酚,2,，,4-,二氯酚,N-,乙基,-N-,（,3-,甲苯）,-N-,乙酰乙二胺,N-,乙基,-N-,（,2-,羟基,-3-,丙磺酰）间甲苯胺,N-,乙基,-N-,（,3-,丙磺酰）,-3,，,5,二甲氧基苯胺,P,2,，,4-DCP,EMAE,TOOS,ESPDMA,500,510,555,555,585,常用的,Trinder,反应生色基团,表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是蓝色醌类，能避免溶血等色素干扰。,利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。,三、酶循环反应测定技术,57,酶循环法,(enzymatic cycling assay),的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶,( Ea,和,Eb),的量。该法测定中所选择酶的,Km,值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。,第四节 同工酶测定,同工酶的定义,同工酶产生的机理,同工酶分析技术,第五节 酶学分析技的影响因素,一、标本因素的影响,溶血、 抗凝剂 、 存放条件,二、测定条件的影响,三、方法因素对测定结果的影响,四、最适条件的选择与确定,肝素,标本不能溶血,及时分离,及时测定,尽量选择血清标本,不能冷冻,一、标本因素的影响,溶血、 抗凝剂 、 存放条件,二、测定条件的影响,波长 样品量与试剂 稀释水量 反应时间 孵育时间 延迟时间 检测时间等,三、方法因素对测定结果的影响,四、最适条件的选择与确定,采用了两个不同的波长即测量波长（又叫主波长p, Primary Wavelength）和参比波长（又叫次波长s, Second Wavelength）同时测定一个样品溶液，以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。,波长,样品量与试剂,样品与反应液总量的比例一旦选定,就不要随意更改,.,稀释水量,反应时间,孵育时间,延迟时间,检测时间,一、标本因素的影响,溶血、 抗凝剂 、 存放条件,二、测定条件的影响,波长 样品量与试剂 稀释水量 反应时间 孵育时间 延迟时间 检测时间等,三、方法因素对测定结果的影响,正向反应与逆向反应 测定的底物与产物 定时法与连续检测法 启动模式,四、最适条件的选择与确定,65,单试剂法,：反应体系中只加一种试剂的方法。,双试剂法,：为消除一些干扰和非特异反应，提高检测结果的准确性，在反应过程中试剂分开配制和加入反应体系。,一、标本因素的影响,溶血、 抗凝剂 、 存放条件,二、测定条件的影响,波长 样品量与试剂 稀释水量 反应时间 孵育时间 延迟时间 检测时间等,三、方法因素对测定结果的影响,正向反应与逆向反应 测定的底物与产物 定时法与连续检测法 启动模式,四、最适条件的选择与确定,底物 缓冲液 温度 辅酶和辅基 激活剂和抑制剂,工具酶 延滞期和线性期 样品与试剂,69,第六节诊断酶学在临床上的应用,一、血浆酶的来源,血浆酶,血浆特异酶,非血浆特异酶,外分泌酶,细胞内酶,71,二、血液中酶浓度的变化机制,1,、合成异常,2,、从损伤细胞中释放增加（,影响酶释放速度和数量的因素,）,3,、清除异常,4,、其他影响,三、临床常用的血清酶,本 章 结 束,