生物化学生物信息的传递上从DNA到RNA

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 生物信息的传递（上）从,DNA,到,RNA,3.1 RNA,的转录,3.2,启动子与转录起始,3.3,原核生物与真核生物,mRNA,的特征比较,3.4,终止与抗终止,3.5,内含子的剪接、编辑及化学修饰,DNA,序列是,遗传信息的贮存者，,它通过自主复制得到永存，并通过,转录,生成信使,RNA,、,翻译,生成蛋白质的过程来控制生命现象。,转录,(transcription),基因表达,翻译,(translation),拷贝出一条与,DNA,链序列完全相同,(U,替换,T),的,RNA,单链的过程，是基因表达的核心步骤；,以新生的,mRNA,为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。,DNA,RNA,Protein,转 录,翻 译,ATGC,RNA,分子,来自,DNA,。储存于,DNA,双链中的遗传信息通过转录酶促反应按照,碱基互补配对,的原则被转化成为,单链,RNA,分子,。,生物体内共有,3,种,信使,RNA(messenger,RNA,，,mRNA),转移,RNA(transfer,RNA,，,tRNA,),核糖体,RNA(ribosomal,RNA,，,rRNA,),转录,(transcription):,是指以,DNA,为模板，在依赖于,DNA,的,RNA,聚和酶催化下，以,4,中,rNTP,（,ATP,、,CTP,、,GTP,和,UTP,）为原料，合成,RNA,的过程。,转录,(,transcription,),生物体以,DNA,为模板合成,RNA,的过程,转录,RNA,DNA,在有些病毒中，,RNA,也可以指导合成,RNA,。,是基因表达的第一步，也是最关键的一步。,以,Double Strand DNA,中的一条单链作为转录模板,(,杂交实验所证实,),T C G A G T A C,A G C T C A T G,C G A G U A C,G C A U,RNA,聚合酶,有意义链,反意义链,RNA,PPi,5,5,3,GTP,UTP,CTP,ATP,UTP,RNA,在,DNA,模板上的生物合成,3,3,5,转 录 过 程,有义链,(sense strand),又称编码链,coding,strand:,指不作模板的,DNA,单链,反义链,(,antisense,strand),又称模板链,template,srand, :,指作为模板进行,RNA,转录的链,(60,年代以前的表示方法与此相反,),没有,A,U G,C,的规律,在依赖,DNA,的,RNA,聚合酶作用下进行转录,A,U,、,C,G,合成,RNA,分子,转录合成,RNA,链的方向为,5,3,，,模板单链,DNA,的极性,方向为,3,5,， 而非模板单链的极性方向与,RNA,链相,同，均为,53,。（书写）,基因转录方式为不对称转录,(,一条单链,DNA,为模板,RNA,聚合酶的结合,),参,与,转,录,的,物,质：,原料,:,4,种,NTP,(,A,TP,U,TP,G,TP,C,TP,),模板,:,DNA,酶,:,RNA,聚合酶,其他蛋白质因子,不对称转录,两层含义：,（,1,）在,DNA,双链分子上，仅一股链可转录,（,2,）模板链非永远在同一条单链上,模 板,为结构基因,（有义链、编码连）,为反义链（模板链）,不对称转录,3,3,5,5,（箭头表示转录产物生成方向）,3.1 RNA,的转录,3.1.1,转录的基本过程,无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括,:,模板识别,、,转录起始,、,通过启动子,及,转录的延伸和终止,。,RNA,的转录包括,promotion. elongation.,terminaton,三过程,从启动子,(promoter),到终止子,(terminator),称为转录单,位,(,transcription,unit) (,转录起始点,),原核生物的转录单位多为,polycistron,in,operon,真,核生物中的,转录单位多为,monocistron, No,operon,转录起点即转录原点记为,1,，其上游记为负值，下游,记为正值,upstream start point downstream,10,1,10,转录起始点,两个相关概念,:,操纵元,(,operon,):,是原核生物基因,表达调控的一个,完整单元，其中,包括结构基因、,调节基因、操纵,子和启动子,i,p,o,z,y,a,No,lac,mRNA,Absence of lactose,Active,i,p,o,z,y,a,-,Galactosidase,Permease,Transacetylase,Presence of lactose,Inactiv,e,酶与模板的辩认结合,1,、转录起始点,开始转录的位点，常标以,+1,2,、结合部位,约为,7,个碱基长度，其中心位于上,游,- 10,bp,处被称为, 10,区,或,Pribnow,盒,(TATA,盒）。该,区具高度保守性，并易解链。,3,、识别部位,RNA,聚合酶,亚基识别的部位，,约,含,6,个碱基长度，其中心位于上游,- 35,bp,处被称为,35,区,。,启动序列,(,原核）,启动子（真核）,顺式作用元件,TGTTGACA,TATAAT,3,5,5,3,DNA,编码链,模板链,- 35,区,- 10,区,+ 1,5,McGPPP,转录起始部位,启动子,基因转录区,RNA,产物,NH,2,翻译开始,转录开始,基本过程,1,、转录起始,原核生物,需要依赖,因子辨认转录起始点，,被辨认的,DNA,区段处,-35,区特定序列。,真核生物,转录起始也需要,RNApol,对起始区,上游,DNA,序列做辨认和结合，并生成起始复合物，,但其上游,DNA,序列（统称为顺式作用元件）不象,原核生物那样典型。,2,、延长,在,RNA,聚合酶催化下，按,5,3,方向合成,5,，,3-,磷酸二酯键。酶,-,DNA-RNA,形成,转录复合物。,3,、终止,原核生物有两种机制：,（,1,）依赖, 因子（,Rho,factor,）,的转录终止,可识别来自,RNA,产物的终止信号，而不是来自,DNA,摸板。,（,2,）非依赖, 因子,的转录终止,终止子特点是,RNA,产物具有发夹结构（茎,-,环结构）和一段富含,polyU,片段。,真核生物的转录终止是与转录后修饰密切相关的：,启动子,(promoter),指,DNA,分子上被,RNA,聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域 ，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点,(,频率、效率,),模板识别阶段,主要指,RNA,聚合酶与启动子,DNA,双链相互作用并与之相结合的过程。,转录起始前，启动子附近的,DNA,双键分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板,DNA,的碱基配对。转录起始就是,RNA,链上第一个核苷酸键的产生。,在原核生物中,通过启动子阶段,转录起始后直到形成,9,个核苷酸短链,此时,RNA,聚合酶一直处于启动子区，新生的,RNA,链与,DNA,模板链的结合不够牢固，很容易从,DNA,链上掉下来并导致转录重新开始。一旦,RNA,聚合酶成功地合成,9,个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进人正常的,延伸,阶段。,所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。一般说来，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。,转录的延伸,RNA,聚合酶离开启动子，沿,DNA,链移动并使新生,RNA,链不断伸长的过程,在,37,时，大肠杆菌,RNA,聚合酶完成该反应的速度为每秒,40,个核苷酸。,RNA,聚合酶的移动,新的单链,DNA,模板,新生,RNA,链的,3,末端不断延伸,解链区形成,RNA-DNA,杂合物,双螺旋重新合成,RNA,链的延伸图解,3,5,RNA-DNA,杂交螺旋,聚合酶的移动方向,新生,RNA,复链,解链,有义链,模板链（反义链）,延长部位,转录的终止,当,RNA,链延伸到转录终止位点时，,RNA,聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，,RNA-DNA,杂合物分离，转录泡瓦解，,DNA,恢复成双链状态，而,RNA,聚合酶和,RNA,链都被从模板上释放出来,复 制 转 录,模板 两股链 模板链（反义链）,原料,dNTP,NTP,配对,A - T , G - C A - U , G - C,聚合酶,DNA,聚合酶,RNA,聚合酶,产物 半保留,DNA,三种,RNA,转录与复制的区别,真核生物,RNA,聚合酶,不能直接识别基因的启动子区，,需要转录调控因子,(,辅助蛋白质,),按特定顺序结合于启动子上，,RNA,聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物。,转录和翻译的速度基本相等，,37,时，转录生成,mRNA,的速度每秒钟合成,14,个密码子，而蛋白质合成的速度大约是每秒钟,15,个氨基酸。,3.1.2,转录机器的主要成分,3.1.2.1 RNA,聚合酶,原核和真核生物的,RNA,在分子组成、种类和生化特性上各有特色。,不需要任何引物,RNA,或,RNA-DNA,双链杂合体不能作为模板,双链,DNA,为模板,4,种核苷三磷酸作为活性前体,Mg2,/Mn2,为辅助因子,一、原核生物的,RNA polymerase (E. coli),1,、全酶,(,Holo,Enzyme),和核心酶,(Core Enzyme),Core Enzyme,Holo,Enzyme,原核生物的,RNA,聚合酶,(DDRP),E. coli,的,RNA,聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（,2, ,）,起始因子,RNA,聚合酶全酶及核心酶电泳图谱,(1),全酶（,Holo,Enzyme,）,用于转录的起始,依靠空间结构与,DNA,模板结合,(,与核心酶结合后,引起的构象变化,),专一性地与,DNA,序列,(,启动子,),结合,结合常数：,10,14,mol,半衰期：数小时,（,10,7,mol 1,秒以下）,转录效率低，速度缓慢（,的结合,）,（,2,） 核心酶 （,Core Enzyme,）,作用于转录的延伸过程（终止）,依靠静电引力,与,DNA,模板结合,（蛋白质中碱性,基团与,DNA,的磷酸根之 间）,非专一性的结合（与,DNA,的序列无关）,结合常数：,10,11,mol,半衰期：,60,秒,此外，新发现的一种,亚基的功能尚不清楚。,2,、各亚基的特点和功能,（,1,）,因子,因子可重复使用,修饰,RNApol,构型,使,Holo,Enzyme,识别启动子的,Sextama,Box(,35,区,),并通过,与模板链结合,2,2,2,2,（,3,）全酶的组装过程,不同的,因子识别不同的启动子,E.coli,中有四种,因子（,70,、,32,、,54,、,28,）,枯草杆菌中有,11,种,因子,（,因子的更替对转录起始的调控）,（,2,）,因子,核心酶的组建因子,促使,RNApol,与,DNA,模板链结合,2,2,前端,因子使模板,DNA,双链解链为单链,尾端,因子使解链的单链,DNA,重新聚合为双链,（,3,）,因子,促进,RNApol,NTP RNA elongation,完成,NMP,之间的磷酸酯键的连接, Editing,功能（排斥与模板链不互补的碱基）,与,Rho,（,）,因子竞争,RNA 3,end,E site,（,elongation site,Rif,R,）,:,对,NTP,非专一性地结,合（催化作用和,Editing,功能）,（,4,）,因子,参与,RNA,非模板链（,sense strand,）的结合,（充当,SSB,）,构成,Holoenzyme,后，,因子含有两个位点,I site,（,initiation site .,Rif,s,）,:,该位点专一性地结合,ATP,或者,GTP,（,需要高浓度的,ATP,或,GTP,）,由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点,有义,DNA,链结合位点（,亚基提供）,DNA/RNA,杂交链结合位点（,亚基提供,）,双链,DNA,解链位点（前端,亚基提供,）,单链,DNA,重旋位点（后端,亚基提供,）,因子作用位点,E. coli,RNA polymerase,用于起始和延伸,只用于起始,36.5 KD,36.5 KD,151 KD,155 KD,11 KD,70 KD,每个细胞中约有,7000,个,RNA,聚合酶分子,每一时刻有,20005000,个酶在执行转录,DNA,模板的功能,因子大大增加聚合酶对启动子的亲和力，并降低酶对非专一位点的亲和力，使酶专一性识别模板上的启动子,转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启动子酶复合物相结合构成新生,RNA,的,5,端，再以磷酸二酯键的形式与第二个核苷酸相结合,起始的终止反映在,因子的释放,当新生,RNA,链达到,6,9,个核苷酸时，能形成稳定的酶,DNA,RNA,三元复合物，并释放,因子，转录进人延伸期,当聚合酶按,5 3,方向延伸,RNA,链时，解旋的,DNA,区域也随之移动。,聚合酶可以横跨约,40,个碱基对，而解旋的,DNA,区域大约是,17,个碱基对。,自由核苷酸能被聚合酶加到新生的,RNA,链上，并形成,DNA-RNA,杂合体。,随着聚合酶在模板上的运动，靠近,3,端的,DNA,不断解旋，同时在,5,端重新形成,DNA,双链，将,RNA,链挤出,DNA-RNA,杂合体。,RNA,的,3,端大约有,20,30,个核苷酸与,DNA,和聚合酶相结合。,RNA,合成过程,起始,双链,DNA,局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,5,3,RNA,启动子（,promotor,),终止子,(terminator),5,RNA,聚合酶,5,3,5,3,5,5,3,离开,二、真核生物的,RNApol,1,、,三种,RNApol,：,根据对,-,鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类,RNApol,最不敏感 （动、植、昆）,RNApol,最敏感,RNApol,不同种类的敏感性不同,2,、 位置和转录产物,RNApol,核仁 活性所占比例最大,转录,rRNA,（,5.8S,、,18S,、,28S,）,RNApol,核质,主要负责,hnRNA,、,snRNA,的,转录,hnRNA,（,mRNA,前体，核不均一,RNA,heterogeneous nuclear RNA,）,snRNA,（,核内小分子,RNA small,nulear,RNA),RNApol,核质,负责,tRNA,、,5S,rRNA,、,Alu,序列和,部分,snRNA,目前在线粒体和叶绿体内发现少数,RNApol,（活性较低）,真核生物,线粒体和叶绿体,中还存在着不同的,RNA,聚合酶。,线粒体,RNA,聚合酶只有一条多肽链，相对分子质量小于,7x10,4,，是已知最小的,RNA,聚合酶之一，与,T7,噬菌体,RNA,聚合酶有同源性,叶绿体,RNA,聚合酶比较大，结构上与细菌中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因组编码,3,、亚基组成：,分子量,500KDa,含两个大亚基和,7,12,个小亚基,RNApol,：,大亚基中有,C,末端结构域,(,carboxy,terminal domain CTD), CTD,中含一保守氨基酸序列的多个重复,Tyr,Ser,Pro,Thr,Ser,Pro,Ser,C,端重复七肽,不同生物中重复数目不一样（酶活性）, CTD,中的,Ser,和,Thr,可被高度磷酸化,磷酸化的,RNApol,被称为,A,非磷酸化的,RNApol,称为,B,CTD,参与转录,B, ,A,使,RNApol,易于离开,启动子进入延伸过程（,10,倍）,真核生物中共有,3,类,RNA,聚合酶，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同。,真核生物,RNA,聚合酶一般有,8,14,个亚基,所组成，相对分子质量,超过,510,5,。,聚合酶中有两个相对分子质量超过,l10,5,的大亚基；,同种生物,3,类聚合酶有,共享,小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中,3,类或,2,类聚合酶所共有的,3,类聚合酶的亚基种类和大小存在两条普遍遵循的原则,3.1.2.2,转录复合物,启动子选择阶段,RNA,聚合酶全酶对启动子的识别,聚合酶与启动子可逆性结合形成,封闭复合物,（,closed complex,）,伴随着,DNA,构象上的重大变化，封闭复合物转变成,开放复合物,(open complex),开放复合物与最初的两个,NTP,相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后,(,RNA,聚合酶、,DNA,和新生,RNA),三元复合物。,强启动子,封闭复合物 开放复合物（不可逆的快反应）,真核生物转录起始复合物的分子量很大：,RNA,聚合酶、,7,种辅助因子（包含多个亚基）。,三元复合物可以进入两条不同的反应途径,一是合成并释放,2,9,个核苷酸的短,RNA,转录物流产式起始,;,二是尽快释放,亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、,DNA,和新生,RNA,所组成的转录延伸复合物,转录的真实性取决于,有特异的转录起始位点,转录起始后按照碱基互补原则准确地转录,模板,DNA,序列及具有特异的终止部位,因子,只有带,因子,的全酶才能专一地与,DNA,上的启动子结合，,选择其中一条链作为模板，,合成均一的产物。,因子的作用只是起始而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责,RNA,链的延伸。,因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。,终止信号,转录起始复合物,转录延伸复合物,RNA,聚合酶,较稳定,3.2,启动子与转录起始,大肠杆菌,RNA,聚合酶与启动子的相互作用主要包括,启动子区的识别,酶与启动子的结合,因子的结合与解离,3.2.1,启动子（,promoter,）,的结构与功能,（,Prok.E.coli,）,1,、,启动子由两个部分组成,（,1,） 上游部分, CAP-,cAMP,结合位点,（基因表达调控的正控制位点）,CAP,（,catabolite,gene Activator Protein,）,降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（,cAMP,）,的受体蛋白,（,2,） 下游部分,RNApol,的进入（结合）位点,35,10,包括识别位点和结合位点（,R B,位点）,2,、,RNA,聚合酶的进入位点,（,1,）,Sextama,框（,Sextama,Box,）, -35,序列，,RNA,聚合酶的松弛（,初始,）结合位点，, RNA,聚合酶依靠其,亚基识别该位点,识别位点（,R,位点）,大多数启动子中共有序列为,T,82,T,84,G,78,A,65,C,54,A,45,重要性,:,很大程度上决定了启动子的强度,（,RNApol,的,因子）,位置在不同启动子中略有变动,（,2,）,Pribonow,框（,Pribonow,Box,）, -10,序列，,RNA,聚合酶的牢固结合位点,结合位点（,B,位点）,一致序列：,T,80,A,95,T,45,A,60,A,50,T,96,（,TATP,U,AT,）,位置范围 ,4,到,13,因此又称,TATA Box,保守,T,启动子的研究：,(RNA,聚合酶保护法,),5,5,RNA,聚合酶保护区,结构基因,保守序列,（,一,致性序列）,开始转录,T T G A C A,A A C T G T,-35,区,(,Pribnow,box),T A T A A T,Pu,A T A T T A,Py,-10,区,1,-30,-5 0,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,RNA,聚合酶全酶在转录起始区的结合,（,3,） 起始位点（,initiation site,）：,1,位点,RNA,聚合酶的转录起始位点,起始,NTP,多为,ATP,或,GTP (,嘌呤,),起始,过程 ：,a.,全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成,（,R,位点被,因子发现并结合,）,b,、,开放型启动子复合物的形成,RNApol,的一个适合位点到达,10,序列区域，诱导富,含,A.T,的,Pribnow,框的“熔解”， 形成,12,17bp,的泡状,物，同时酶分子向,10,序列转移并与之牢固结合,开放型启动子复合物使,RNApol,聚合酶定向,两种复合物均为二元复合物（,全酶和,DNA,）,12,17bp,c.,在开放型的启动子复合物中，,RNApol,的,I,位点和,E,位点的,核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（,亚基）,三元复合物形成,+1,位多为,CAT,模式,位于离开保守,T 69,个核苷酸处,-6-9,bp,-,G,C T,A,TTG,ACA,TA,TAA,T,-16-18,bp,-,+1,-35 sequence,-10 sequence,（,4,）,因子解离,核心酶与,DNA,的亲和力下降,起始过程结束,核心酶移动进入延伸过程,转录的起始过程,核心酶,12,17bp,（,亚基）,CAP-,cAMP,结合位点 （也称,CAP,位点）,转录调控中，,I ,阻遏蛋白,负调控,lac,操纵子模型,I,许多基因的表达还存在正调控机制,例如,: E.coli,培养基中乳糖和葡萄糖共存时,只有葡萄糖被,利用,原因：,CAP,位点的正调控,葡萄糖缺少时 ，腺苷酸环化酶将,ATP ,cAMP,，,cAMP,与,CAP,位点结合,此时启动子的进入位点才能,与,RNApol,结合,葡萄糖存在时，,cAMP,不能形成，没有,CAP,cAMP,与,CAP,位点结合，启动子的,RNApol,进入位点不能结,合,RNApol,因此,一个操纵元中有两道控制开关,只有同时打开,结构基因才,能进行转录。,（对,lac,操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）,（,1,）,CAP,位点的组成,（,70, ,40,）,位点,：,70, ,50,包括一个,IR,序列,强结合位点,位点,：,50, ,40,弱结合位点,位点,对位点,具有协同效应（,cooperativity,）,（,2,） 位点,结合,CAP,cAMP,复合物后，促使,RNApol,进入,Sextama,Box,最终与,10,序列结合起始转录,原因：,CAP,cAMP,复合物与位点,结合,Sextama,Box,富含,G,.,C,区域（,G.C,岛区）稳定性降低,Pribnow,Box,的溶解温度降低,促进开放型启,动子复合物的形成,促进转录,4,、,RNApol,在,DNA,上结合位点的鉴定,DNase,法,-40bp,而足迹法（,footprinting,）,结果相对准确,足迹法原理：,限制酶切割结合有,RNApol,的,DNA ,大分子,DNA,末端标记该,DNA,（,Klenow,片段标记,3,碱性磷酸酯,酶标记,5,）,用内切酶降解,DNA,（,控制反应条件）,凝胶电泳分离，放射自显影观察,限制酶切,分离,大片段,DNA,末端标记大分子,DNA,重新结合,RNApol,作对照,直接用,DNase,进行降解,电泳,用微量,DNase,降解,电泳,用足迹法鉴定出来的,RNApol,与,DNA,的结合区域为,+20 ,50,（,40,），大约,60 70,bp,实验中还发现,.,实验中还发现,DNA,的两条链受,RNApol,的保护程度不同，说明,RNApol,与两条链的结合是不对称的，表明转录只需要一条模板，即单链转录,RNA,聚合酶保护法,开始转录,T T G A C A,A A C T G T,-35 区,T A T A A T,Pu,A T A T T A,Py,-10 区,1,-30,-50,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,原核生物启动子保守序列,5,5,RNA,聚合酶保护区,结构基因,3,3,原核生物启动子,35,区：,一致性序列为,TTGACA,是,RNA-,pol,的,辨认位点,10,区：,一致性序列为,TATAAT,又叫,Pribnow,盒,是,RNA-,pol,的,结合位点,真核生物启动子,5,、 启动子各位点与转录效率的关系,（,1,）,35,序列与,10,序列与转录效率的关系,标准启动子,35 TTGACA,10 TATAAT,不同的启动子,a.,与标准启动子序列同源性越高,启动强度越大,b.,与标准启动子同源性越低,启动强度越小,c.,与标准启动子差异很大时,由另一种,因子启动,原因,:,35,序列通过被,因子识别的容易,决定启动子强度,10,序列影响开放型启动子复合物形成的速度,决定启动子强度,启动子上升突变、启动子下降突变,（,2,） ,35,序列与,10,序列的间隔区与转录效率的关系,碱基序列并不重要,间距非常重要,，,17bp,的间距转录效率最高,间距上的突变种类：,间距趋向于,17bp,上升突变,间距远离,17bp,下降突变,E.Coli,各,识别的启动子的序列,由含,70,RNA,多聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子,3.2.2,启动子区的识别,在启动子区,DNA,双螺旋结构中，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶上的某些基团是,氢键供体,，而,4,种碱基中的某些基团是,氢键受体,。由于它们分别处于,DNA,双螺旋的,大沟或小沟内,，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合。,RNA,聚合酶不直接识别碱基对本身，,是通过氢键互补的方式识别启动子的,3.2.3,酶与启动子区的结合,在,RNA,聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链,DNA,相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物。解链区一般在,-9,+13,之间,，而酶与启动子结合的主要区域在其,上游,。,一旦开链区解链，酶分子能以正确的取向与解链后的有关单链相互作用，形成开链复合物。,因此，,RNA,聚合酶既是双链,DNA,结合蛋白，又是单链,DNA,结合蛋白。,DNA,开链是按照,DNA,模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。,3.2.4 -10,区和,-35,区的最佳间距,在原核生物中，,-35,区与,-10,区之间的距离大约是,16,19bp,保持启动子这二段序列以及它们之间的距离都是重要的，否则就会改变它所控制基因的表达水平。,小于 15 bp 或大于 20 bp 都会降低启动子的活性,因为增减,bp,，,-35,区相对于,-10,区旋转（增减一个,bp,会使两者之间的夹角发生,36,的变化）所产生的,超螺旋会发生改变。,若要使酶与,DNA,在这个区域内保持正确的取向，就必须使二者之一发生扭曲，需要增加结合自由能。,细菌中常见两种启动子突变,下降突变,(down mutation),上升突变,(up mutation),如果把,Pribnow,区从,TATAAT,变成,AATAAT,就会大大降低其结构基因的转录水平,;,增加,Pribnow,区共同序列的同一性。例如，在乳糖操纵子的启动子中，将其,Pribnow,区从,TATGTT,变成,TATATT,，就会提高启动子的效率，提高乳糖操纵子基因的转录水平。,3.2.5,增强子及其功能,增强子的发现,从,SV40,开始，,在,SV40,的转录单元上发现它的转录起始位点上游约,200bp,处,有两段,72bp,长的,重复序列，,它们不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的起始，除去这两段序列会,.,若保留其中一段或将之取出插至,DNA,分子的任何部位，就能,这种能强化转录起始的序列为增强子或强化子,(enhancer),。后来在许多基因的启动区中陆续发现了增强子的存在。,把,-,珠蛋白基因置于带有上述,72bp,序列的,DNA,分子上，发现它在体内的转录水平,提高了,200,倍。,而且，无论把这段,72bp,序列放在转录起点上游,1400bp,或下游,3300bp,处，它都有转录增强作用。增强子通过影响染色质,DNA-,蛋白质结构并改变超螺旋而改变模板的整体结构，使得,RNA,聚合酶更容易与模板,DNA,相结合，起动基因转录。,3.2.6,真核生物启动子对转录的影响,启动子是确保转录精确而有效地起始的,DNA,序列。,1979,年，美国科学家,Goldberg,首先注意到真核生物中，由,RNA,聚合酶,II,催化转录的,DNA,序列,5,上游区有一段,与原核生物,Pribnow,区相似的富含,TA,的保守序列。,由于该序列前,4,个碱基为,TATA,，所以又,称为,TATA,区,(TATA box),。,此后,10,多年间，科学家通过对许多基因启动子区的分析，发现绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式。简单地说，真核基因的启动子在,-25,-35,区含有,TATA,序列，,在,-70,-80,区含有,CCAAT,序列,(CAAT box),，在,-80,-110,含有,GCCACACCC,或,GGGCGGG,序列,(GC box),。,TATA,区上游的保守序列称为,上游启动子元件,(upstream promoter element,，,UPE),或称,上游激活序列,(upstream activating sequence,，,UAS),。,原核和真核基因转录起始位点上游区的结构存在很大的差别。,原核基因启动区范围较小，,TATAAT (,Pribnow,区,),的中心位于,-10,，上游只有,TTGACA,区,(-35,区,),作为,RNA,聚合酶的主要结合位点，参与转录调控,;,真核基因的调控区较大，,TATA A/TA,区位于,-20,-30,，而,-40,-110,区为上游激活区。,真核基因除了含有可与原核基因启动子相对应的,CAAT,区（,70,78,区）之外，大多数基因还拥有,GC,区和增强子区。,TATA,区和其他两个,UPE,区的作用有所不同。,主要作用是使转录精确地起始，如果除去,TATA,区或进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如,CAAT,区或,GC,区突变后明显，但发现所获得的,RNA,产物起始点不固定,CAAT,区或,GC,区是决定转录产物产率高低的,CAAT,区和,GC,区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。,CAAT,区对,转录起始频率,的影响最大，该区任一碱基的改变都将极大地影响靶基因的转录强度，而启动区其他序列中一两个碱基的置换则没有太大的影响。,在,TATA,区和相邻的,UPE,区之间插入核苷酸也会使转录减弱。,尽管这,3,种启动子区序列都有着重要功能，但并不是每个基因的启动子区都包含这,3,种序列。,有些基因，如,SV40,的早期基因，缺少,TATA,和,CAAT,区，只有,6,个串联在上游,-40,-110,位点的,GC,区,;,有些基因，如组蛋白,H2B,，不含,GC,区，但有两个,CAAT,区，一个,TATA,区。,真核细胞中存在着大量特异性或组成型表达的、能够与不同基因启动子区,UPE,相结合的,转录调控因子,。基因转录,实际上是,RNA,聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。,一、真核生物的,RNApol,1,、,三种,RNApol,：,根据对,-,鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类,RNApol,最不敏感 （动、植、昆）,RNApol,最敏感,RNApol,不同种类的敏感性不同,2,、 位置和转录产物,RNApol,核仁 活性所占比例最大,转录,rRNA,（,5.8S,、,18S,、,28S,）,RNApol,核质,主要负责,hnRNA,、,snRNA,的,转录,hnRNA,（,mRNA,前体，核不均一,RNA,heterogeneous nuclear RNA,）,snRNA,（,核内小分子,RNA small,nulear,RNA),RNApol,核质,负责,tRNA,、,5S,rRNA,、,Alu,序列和,部分,snRNA,目前在线粒体和叶绿体内发现少数,RNApol,（活性较低）,3,、亚基组成：,分子量,500KDa,含两个大亚基和,7,12,个小亚基,RNApol,：,大亚基中有,C,末端结构域,(,carboxy,terminal domain CTD), CTD,中含一保守氨基酸序列的多个重复,Tyr,Ser,Pro,Thr,Ser,Pro,Ser,C,端重复七肽,不同生物中重复数目不一样（酶活性）, CTD,中的,Ser,和,Thr,可被高度磷酸化,磷酸化的,RNApol,被称为,A,非磷酸化的,RNApol,称为,B,CTD,参与转录,B, ,A,使,RNApol,易于离开,启动子进入延伸过程（,10,倍）,二、 真核生物的启动子,三种,RNApol,三种转录方式,三种启动子,三类基因，,类,类,类,1,、,RNApol,的启动子,结构最复杂,位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成,通用型启动子（无组织特异性）,（,1,） 帽子位点（,cap site,）：,转录起始位点,与,Prok,.,的“,CAT,模式”相似,（,2,）,TATA,框（,Hogness,框,或,Goldberg-,Hogness,框,）,位于,30,处,一致序列为,T,82,A,97,T,93,A,85,A,63,（,T,37,）,A,83,A,50,（,T,37,）,定位转录起始点的功能,（类似原核的,Pribnow,框）, TATA,是绝大多数真核基因的正确表达所必需的,（,3,）,CAAT,框（,CAAT box,）,位于,75bp,处,一致序列为,GG,C/T,CAAT,CT,前两个,G,的作用十分重要,(,转录效率,),增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性,（距转录起始点的距离，正反方向）,以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在,（,4,） 增强子（,enhancer,）,（,又称远上游序列,far upstream sequence,）,在,100,以上, SV40,的两个正向重复研究得最清楚（,DR,）,-107178,、,179 ,250,各,72bp,该增强子的特点如下：,对依赖于,TATA,框的转录的增强效应高于不依赖,的情况,距离效应,:,离,72bp,越近的容易起始转录,转录方向离开,72bp,的起始序列优先转录,细胞类型的选择：不同类型中作用有差异,表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）,（,5,）,GC,框 （,GC box,）,位于,90,附近，较常见的成分,核心序列为,GGGCGG,可有多个拷贝，也可以正反两方向排列,（,6,）其他元件,八聚核苷酸元件,（,octamer,element,OCT,元件,）,一致序列为,ATTTGCAT,K,B,元件 一致序列为,GGGACTTTCC, ATF,元件 一致序列为,GTGACGT,还有一些位于起始点下游的相关元件,（,7,） 不同元件的组合情况,不同元件的,数目、位置、和排列方向,均有差异,例如：,SV40,的早期启动子中有,6,个,GC,框,小结,：,不同启动子中,每种元件与转录起始点的距离不同,不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交,启动子功能没有变化,各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，,组成起始复合物，,蛋白因子间的相互作用决定,了转录的起始,2,、,RNApol,启动子结构,（,1,） 分为三类，每种识别方式不同,a,、,下游启动子（内部启动子）,位于转录起始点的下游,5SRNA,和,tRNA,基因,可分为两类,b,、,上游启动子,snRNA,（,2,）内部启动子的发现,最早发现于非洲爪蟾的,5S,rRNA,基因,试验设置：,非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系，,进行缺失试验,以不同长度的,5S,rRNA,基因为模板进行转录,结果：,缺失,55,以前和缺失,80,以后的序列都能正常转录,缺失,55,到,80,序列不能转录,结论：,5S,rRNA,基因的启动子位于基因内部,该启动子可使,RNApol,在其上游的,55bp,处起始转录,（,3,） 内部启动子分为两类,均含两个短序列元件，中间由其他序列隔开,第一类： 含,A,框和,C,框 （,5S,rRNA,基因）,第二类： 含,A,框和,B,框 （,tRNA,基因、,VARNA,基因）,间隔序列长短差异很大,其中内部启动子起被,RNApol,识别的作用,三、真核生物的转录过程,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，,RNA-,pol,不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,转录起始点,TATA,盒,CAAT,盒,GC,盒,增强子,顺式作用元件,(,cis,-acting element),1.,转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1,：,ATTTGCAT,八聚体,2.,转录因子,能直接或间接辨认和结合转录上游区段,DNA,的蛋白质，统称为,反式作用因子,(trans-acting factors),。,反式作用因子中，直接或间接结合,RNA,聚合酶的，则称为,转录因子,(trans-,criptional,factors, TF),。,参与,RNA-,pol,转录的,TF,转录因子,亚基和,(,或,),分子量（,kDa,）,功能,TFD,TBP,，,38,结合,TATA,盒,TAF,辅助,TBP-DNA,结合,TFA,12,，,19,，,35,稳定,D-DNA,复合物,TFB,33,促进,RNA-,pol,结合,TFF,30,，,74,解螺旋酶,TFE,57(,),，,34(,),ATPase,TFH,蛋白激酶，使,CTD,磷酸化,3.,转录起始前复合物,(pre-initiation complex, PIC),真核生物,RNA-,pol,不与,DNA,分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,TBP,TAF,TF II H,4.,拼板理论,(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要,3,至,5,个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性和专一性的复合物，再与,RNA,聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-,pol,前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-,Pol,RNA-,Pol,RNA-,Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,和转录后修饰密切相关,5 -AAUAAA-,5 -AAUAAA-,Poly,(,A,),mRNA,核酸酶,-GUGUGUG,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,RNA-,pol,（三）转录终止,3.3,原核生物与真核生物,mRNA,的特征比较,mRNA,在大肠杆菌细胞内占总,RNA,的,2%,左右,(,tRNA,占,16%,，而,rRNA,则占,80%,以上,),。,直到,20,世纪,70,年代初才首次将这一重要物质从细胞中分离出来。,现已清楚，许多基因的,mRNA,在体内还是相当稳定的，半衰期从,几个小时到几天不等,。目前，人们己能从几乎所有生物体内分离纯化编码任何蛋白质的,mRNA,。,mRNA,在所有细胞内执行着相同的功能，即通过密码三联子翻译生成蛋白质，但其生物合成的具体过程和成熟,mRNA,的结构在原核和真核细胞内是不同的。 真核细胞,mRNA,最大特点在于它往往以一个较大相对分子质量的前体,RNA,出现在,核内,，只有成熟的、相对分子质量明显变小并经化学修饰的,mRNA,才能进入细胞质参与蛋白质的合成。,真核细胞,mRNA,的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内,原核生物中，,mRNA,的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往往在,mRNA,刚开始转录时就被引发,一个原核细胞的,mRNA(,包括病毒,),有时可以编码几个多肽，而一个真核细胞的,mRNA,最多只能编码一个多肽,原核生物常以,AUG,作为起始密码子，有时,GUG,或,UUG,也作为起始密码子；真核生物几乎永远以,AUG,作为起始密码子,3.3.1,原核生物,mRNA,的特征,细菌基因的转录与翻译是紧密相联的，基因转录一旦开始，核糖体就结合到新生,mRNA,链的,5,端，启动蛋白质合成，而此时该,mRNA,的,3,端还远远没有转录完全。在电子显微镜下，我们可以看到一连串核糖体紧紧跟在,RNA,聚合酶后面。,1.,原核生物,mRNA,的半衰期短,绝大多数细菌,mRNA,的半衰期很短，,mRNA,的降解紧随着蛋白质翻译过程发生。转录开始,1 min,后，降解就开始了，当一个,mRNA,的,5,端开始降解时，其,3,端部分仍在合成或被翻译。,mRNA,降解的速度大概是转录或翻译速度的一半。,因为基因转录和多链肽延伸的速度基本相同，所以细胞内某一基因产物,(,蛋白质,),的多少决定于转录和翻译的起始效率，以大肠杆菌色氨酸合成酶基因为例，平均每分钟约有,15,次转录起始，这些,mRNA,链从生成到降解平均被翻译,10,次，所以，稳定状态下细胞中每分钟生成,150,个多肽。我们所讨论的,mRNA,的半衰期只是统计学上的平均值。,细菌,mRNA,可以同时编码不同的蛋白质。编码多个蛋白质的,mRNA,为多顺反子,mRNA,。多顺反子,mRNA,是一组相邻基因的转录产物。这一组基因被称为一个操纵子。,单顺反子,mRNA,为只编码一个蛋白质的,mRNA,。,2,、许多原核生物,mRNA,以多顺反子的形式存在,所有,mRNA,都被分成,3,部分,:,编码区,、,位于,AUG,之前的,5,端上游非编码区,以及,位于终止密码子之后不翻译的,3,端下游非编码区,。,编码区始于起始密码子,AUG,，经一连串编码氨基酸的密码子直至终止密码子。,对于多顺反子,mRNA,中的第一个顺反子来说，一旦,mRNA,的,5,端被合成，翻译起始位点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始就会受其上游顺反子结构的调控。,情况一,第一个蛋白质合成终止以后，核糖体分解成大、小亚基，脱离,mRNA,模板，第二个蛋白的翻译必须等到新的小亚基和大亚基与该蛋白起始密码子相结合后才可能开始,情况二,前一个多肽翻译完成以后