4第四章-酶活力的测定

,张晓静,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,张晓静,2009.09,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,张晓静,2009.09,*,单击此处编辑母版标题样式,酶制剂技术,张晓静,第四章,酶活力的测定,主讲：张晓静,第四章 酶活力的测定,第一节 酶的结构与性质,(,略,),第二节 酶活力测定方法,第二节 酶活力测定方法,一、酶活力,二、酶活力的测定,张晓静 2009.09,一、酶活力,酶活力,是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大，酶活力越高，反之越低。,酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测定产物的增加量为准。,酶活力的测定就是测定酶促反应的初速率。,1.,概念,张晓静 2009.09,一、酶活力,酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示,即酶单位,(activity unit,，,U),。,酶单位的定义,：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示，即“,U/g”,或“,U/mL”,。,世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。同一种酶往往有几种不同的单位。,例如，,1IU,l,mol/min,；,1Kat=1mol/s,2.,酶活力单位,张晓静 2009.09,一、酶活力,酶活力的测定要在最适条件下进行,，即最适温度、最适,pH,、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等，只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力大小。,测定酶活力大小时，通常要求底物浓度足够大，测定底物浓度的变化在起始浓度的,5,以内的速率，这样可以保证所测定的速率是最初速率。此结果能比较可靠地反映酶的含量。,张晓静 2009.09,一、酶活力,3.,酶的比活力,酶的比活力代表酶的纯度，通常用下式表示：,酶比活力,=,酶活力单位数,(U)/,蛋白质量,(mg),有时也采用每克,(g),酶制剂或每毫升,(mL),酶制剂含有多少个活力单位来表示。,比活力的大小可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。比活力是酶学研究及生产中经常使用的指标。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,1.,酶活力的测定步骤,要求酶活力的测定方法：快速、简便、准确。,酶活力测定均包括两个阶段：首先要在一定的条件下，酶与其作用底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物变化的量。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,酶活力,的测定步骤,底物,反应条件,反应时间,底物或产物,变化量,选择底物,配制底物溶液,确定酶促反应条件：,pH,、温度等,准确计时并终止反应,运用各种检测技术，快速、简便、准确的测定变化量,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,底物：,根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。要求所使用的底物均匀一致，达到一定的纯度。有些底物溶液要求新鲜配制，有些则可预先配制后置冰箱保存备用。,反应条件：,据资料或试验结果，确定酶促反应的温度、,pH,等条件。温度可选在室温,(25),、体温,(37),、酶促反应最适温度或其他选用的温度，一般在恒温装置内进行。,pH,应是酶促反应的最适,pH,，采用一定浓度和一定,pH,的缓冲溶液来保持。反应条件一经确定，在反应过程中应尽量保持恒定不变。有些酶促反应要求激活剂等其他条件，应适量添加。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,底物或产物的变化量：,反应到一定时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物增加量或底物的减少量。为了准确地反应酶促反应的结果，应尽量采用快速、简便、准确的方法测出结果。,反应时间：,在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。反应到一定时间及时终止反应。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。常用：加热、添加酶变性剂、加入酸液或碱液、冰浴等。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,2.,酶活力的测定方法,测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测法、化学检测法等生化检测技术。,一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况选用。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,1.,分光光度法,2.,荧光法,酶 活 力 的 测 定 方 法,3.,同位素测定法,4.,电化学方法,5.,其他方法,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,1.,分光光度法,分光光度法,主要利用底物和产物在紫外光或可见光部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。其优点是简便、节省时间和样品，可检测到,nmol/L,水平的变化。该方法可以连续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测定中一种重要的方法之一。几乎所有的氧化还原酶都可以用此法测定。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,由于分光光度法有其独特的优点，因此可以把一些原来没有光吸收变化的酶反应通过与一些能引起光吸收变化的酶反应偶联，使第一个酶反应的产物转变成为第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。这种方法称为酶偶联测定法。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,2.,荧光法,荧光法,主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测定。由于荧光方法的灵敏度往往比分光光度法要高若干个数量级，而且荧光强度和激光的光源有关，因此在酶学研究中越来越多地被采用，特别是一些快速反应的测定方法。,该法缺点：易受其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸收和发射荧光，这种干扰在紫外区尤为显著，故用荧光法测定酶活力时，应尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,3.,同位素测定法,用带有放射性同位素标记的底物经酶作用后得到产物，通过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出酶的活力单位。,已知六大类酶几乎都可以用此方法测定。,通常用于底物标记的同位素有,3,H,、,14,C,、,32,P,、,35,S,和,131,I,等。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,优点：反应灵敏度极高，可直接用于酶活力的测定，也可用于体内酶活性测定。特别是适用于低浓度的酶和底物的测定。,缺点：操作繁琐，样品需分离，反应过程无法连续跟踪，且同位素对人体有损伤作用。辐射猝灭会引起测定误差，如,3,H,发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,4.,电化学方法,电化学方法包括：,pH,测定法和离子选择电极法等。,pH,测定法最常用的是玻璃电极，配合一高灵敏度的,pH,计，跟踪反应过程中,H,+,变化的情况，用,pH,的变化来测定酶的反应速率。也可以用恒定,pH,测定法，在酶反应过程中，所引起的,H,+,的变化用不断加入碱或酸来保持其,pH,恒定，用加入的碱或酸的速率来表示反应速率。用此法可以测定许多酯酶的活力。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,在使用离子选择电极法测定某些酶的酶活力时,用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应。如葡萄糖氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。,张晓静 2009.09,二、酶活力的测定,5.,其他方法,除上述方法外，还有一些测定酶活力的方法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法等，但这些方法使用范围有限，灵敏度较差,只是应用于个别酶活力的测定。,张晓静 2009.09,教材及参考书（第四章）,张晓静 2009.09,