04第四章药物定量分析与分析方法验证 (2)

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 药物定量分析与分析方法验证,第四章 药物定量分析与分析方法验证,定量分析样品前处理方法,定量分析方法特点,药品质量标准分析方法验证,1,2,3,第一节、定量分析样品前处理方法,Pretreatment of sample used in quantitative analysis,定量分析样品前处理方法,概 述,1,2,泛影酸,碘番酸,碘苯酯,概 述,本节重点：含金属或含卤素、氮硫磷等特殊元素的药物。,磺溴酞钠,三氯叔丁醇,酒石酸锑钾,富马酸亚铁,含金属有机药物,定量分析样品前处理方法,直接测定法,含金属原子或,C-M,不牢固的有机金属原子,水溶液中直接电离,经水解后测定法,卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）,直接回流后测定,碱化回流后测定（,例：三氯叔丁醇的含量测定,）,硫酸水解后测定（,例：十一烯酸锌的含量测定,）,经氧化还原后测定法,卤素联芳环牢固（一般用于测碘）,碱性还原后测定法如泛影酸,酸性还原后测定法如碘番酸,利用药物中可,游离,的金属离子的氧化性测定含量：在碱性溶液中加还原剂（如锌粉）回流，使,C-I,键破坏,不经有机破坏,的分析方法,:,经有机破坏,的分析方法,含金属原子及卤素、氮、硫、磷等有机药物结构中待测原子与,C,原子结合牢固。,湿法破坏：,适用于含氮有机合成药物和生物制品中氮、磷、硫柳汞、氯化钠分析的前处理。,H,2,SO,4,-,HClO,4,：,氧化剂和分解剂,H,2,SO,4,-HNO,3,：,H,2,SO,4,-MSO,4,：,金属以高价态存在,H,2,SO,4,-KMnO,4,：,凯氏定氮法：略,干法破坏：,适用于,卤素、硫、磷等有机药物中硒和砷盐的分析,高温炽灼法：用于卤素。加,无水碳酸钠或氧化镁等，注意温度,氧瓶燃烧法：待测药物有机结构,+O,2,=CO,2,+H,2,O,，待测元素转变成氧化物。,A.,燃烧瓶,B.,铂丝网,C.D.,盛固体样品滤纸及其折叠法,E.F.G.,称取液体样品方法,7mm,50mm,30mm,尾,部,7mm,13mm,20mm,25mm,35,6mm,16,6mm,滤,纸,滤,纸,A,G,F,E,D,C,B,氧瓶燃烧装置及称样方法,氧瓶燃烧法,样品,吸收液,测定方法,含,氟,有机药物,H,2,O,pH4.3 HAc-NaAc,Buffer,茜素氟蓝,分光光度法,含,氯,有机药物,NaOH,溶液,银量法 汞量法,分光光度法,含,溴,有机药物,H,2,O,2,-NaOH,液,或,NaOH,液,-,银量法 分光法,硫酸肼饱和液,含,碘,有机药物,NaOH,液,-,银量法 碘量法,硫酸肼饱和液,汞量法 分光法,碘苯酯含量测定,取本品约,20mg,，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用,NaOH,T.S.2ml,与,H,2,O 10ml,为吸收液，待吸收完全后，加,溴醋酸,溶液,10 ml,，密塞，振摇放置数分钟，加,甲酸,约,1ml,，用水洗涤瓶口，并通入空气流约,35min,，以除去剩余的溴蒸气，加,KI,2g,，密塞，摇匀，用,Na,2,S,2,O,3,液,(,0.02mol/L,),滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每,1ml,的硫代硫酸钠液,(0.02mol/L),相当于,1.388mg,的,C,19,H,29,IO,2,日本和英国生物学家共同获得诺贝尔生理学或医学奖,山中伸弥（,Shinya Yamanaka,），,1962,年出生于日本大阪府，日本医学家，京都大学再生医科研究所干细胞生物系教授，大阪市立大学医学博士,(1993,年,),，美国加利福尼亚州旧金山心血管疾病研究所高级研究员。,约翰,戈登,(JohnB.Gurdon),，,1933,年出生于英国汉普郡。,1971,年当选英国皇家学会会员，,1983,年进入剑桥大学动物系，担任细胞生物学讲座教授，现任职于剑桥大学戈登学院。,1989,年获得以色列沃尔夫医学奖。被誉为动物细胞全能型研究的先驱。,近年诺贝尔生理学或医学奖,得主及其主要成就,2011,年，美国科学家布鲁斯,博伊特勒、法国科学家朱尔斯,霍夫曼和加拿大科学家拉尔夫,斯坦曼。他们发现了,免疫系统激活的关键原理,，这使人们对人体免疫系统的认识有了革命性的改变。,2010,年，英国生理学家罗伯特,爱德华兹。他在体外受精技术领域做出的开创性贡献。,2009,年，美国科学家伊丽莎白,布莱克本、卡萝尔,格雷德和杰克,绍斯塔克。他们解决了一个生物学的重要课题，即,染色体在细胞分裂过程中是怎样实现完全复制，同时染色体如何受到保护而不至于发生降解,。,两位美国科学家分享,2012,年诺贝尔化学奖,美国科学家罗伯特,J,勒夫科维兹,(Robert J.Lefkowitz),与科学家布莱恩,K,卡比尔卡,(Brian K.Kobilka),因在,G,蛋白偶联受体方面的研究,获得,2012,年诺贝尔化学奖。,人物介绍,罗伯特,J,勒夫科维兹,，,1943,年,04,月,15,日出生在纽约，毕业于哈佛大学，研究领域为受体生物学与生物化学，目前在杜克大学任职，在霍华德,休斯医学研究所从事研究工作。,2007,年获得美国国家科学奖章。,布莱恩,科比尔卡,，,1955,年出生，美国斯坦福大学医学院教授，分子细胞生理学和医学部博士。他是,ConfometRx(,一家专注于,G-,蛋白偶联受体的生物技术公司,),的共同创办人。他在,2011,年成为美国国家科学院院士。,G,蛋白偶联受体是一种与三聚体,G,蛋白偶联的细胞表面受体。含有,7,个穿膜区，是迄今发现的最大的受体超家族，其成员有,1000,多个。与配体结合后通过激活所偶联的,G,蛋白，启动不同的信号转导通路并导致各种生物效应,。,G,蛋白偶联受体,近年诺贝尔化学奖得主及其主要成就回顾,2011,年，以色列科学家达尼埃尔,谢赫特曼因,发现准晶体,而获奖。准晶体是一种介于晶体和非晶体之间的固体，准晶体的发现不仅改变了人们对固体物质结构的原有认识，由此带来的相关研究成果也广泛应用于材料学、生物学等多种有助于人类生产、生活的领域。,2010,年，美国科学家理查德,赫克与日本科学家根岸荣一和铃木章因在有机合成领域中,钯催化交叉偶联反应方面的卓越研究成果,而获奖。这一成果广泛应用于制药、电子工业和先进材料等领域，可以使人类造出复杂的有机分子。,2009,年，英国科学家文卡特拉曼,拉马克里希南、美国科学家托马斯,施泰茨和以色列科学家阿达,约纳特因对“,核糖体的结构和功能”研究,的贡献而获奖。,容量分析法：,将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（用适当方法指示），然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。,光谱分析方法,UV-VIS,分光光度法,荧光分析法,色谱分析法,HPLC,法,GC,法,液质联用法,第二节、定量分析方法的特点,目的：,证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求,效能指标：,评价分析方法的尺度,效能指标内容包括,:,精密度,准确度,检测限,定量限,选择性,线性和范围,耐用性,第三节、药品分析方法验证,(1),准确度,（,Accuracy,）：,测量值与真实值接近的程度,表 示,:,回收率,测定方法：回收试验,加样回收试验,数据要求：至少用,9,个测定结果进行评价（,3,浓度，,3,次）；报告中包括回收率（,%,）、,RSD,或可信度。,效能指标,(2),精密度（,Precision,）：,定 义：,同一样品多次测量值之间相互接近的程度,表 示：,偏差（,Deviation,，,d,），标准偏差（,Standard deviation,SD,）,相对标准偏差（,Relative Standard deviation,RSD,），至少用,6,次结果进行评价。,重复性：,同一实验室，同一人多次测定的精密度,中间精密度：,同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度,重现性：,不同实验室，不同人测定的精密度,(3),专属性（,Specificity,）：,指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。,鉴别反应,含量测定和杂质测定,(4),检测限（,limit of detection,，,LOD,）：,药物能被检出的最低浓度（,g/ml,）,测 定,:,信噪比法（,S:N=3,）,(5),定量限（,1imit of quantitation,，,LOQ,）：,药物能被定量测出的最低浓度（,g/ml,）,测 定,:,信噪比法（,S:N=10,）,(6),线性与范围（,linearity and range,）：,待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围,线性关系：,Y=a+bx,（,r=0.9999),线性程度：相关系数,至少,5,个浓度,原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的,80%-,120%,。,制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的,70%-,130%,。,溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的,20%,。,(7),耐用性（,robustness,）,:,测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度。,HPLC,法变动因素有：,流动相组成与,pH,，色谱柱，柱温，流速等。,GC,法变动因素有：,色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。,检验项目和验证内容：,项目内容,鉴别,杂质测定,含量测定及溶出量测定,定量,限度,准确度,精密度,重复性,中间精密度,专属性,检测限,定量限,线性,范围,耐用性,已有重现性验证，不需验证中间精密度,如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充,视具体情况予以验证,第四节 生物样品分析的基本要求,一、常用样品的种类、采集和储贮藏,二、生物样品分析前处理技术,三、定量分析方法验证,生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比,较容易得到的血液（血浆、血清、全血）尿液、唾液。,血样,:,血浆（,plasma,）和血清（,serum,）是最常用的生物样品。,唾液,:,尿液,:,一、常用样品的种类、采集和储贮藏,（一）去除蛋白质,1,加入与水相混溶的有机溶剂,2,加入中性盐,3,加入强酸,4,加入含锌盐及铜盐的沉淀剂,:,与,Pr,羧酸,5,酶解法,（二）缀合物的水解,（三）有机破坏：金属离子,-,消解剂,（四）分离、纯化与浓集,1,液,-,液萃取法（,liquid-liquid extraction,LLE,）,2,液,-,固萃取法（,liquid solid extraction,LSE,）,3,被测组分的浓集,二、生物样品分析前处理技术,（五）化学衍生化,1,GC,中化学衍生化法,2,HPLC,中化学衍生化法,三、,定量分析方法的验证,-,生物样品分析,（一）特异性,内源性物质不得干扰原药、代谢物,（二）标准曲线,r0.9900,，至少,5,个浓度，不许外延,（三）精密度和准确度,批内和批间,RSD15,、,20,相对回收率,85,115,（,80,120,）,（四）最低定量限,LOQ,3,5,倍,t,1/2,，或,1/10,1/20,倍,C,max,（五）样品稳定性,室温、冻融、长期冰冻,（六）提取回收率（绝对回收率）,一般低于,100,，须稳定,（七）质控样品,已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以确保定量测定的准确度,定量分析方法的验证,-,生物样品分析,样品,固相净化,及,反相高效液相色谱法,测定血浆中茶碱,伍朝筼等 药学学报,1989,24(10):769