第十六章基因和蛋白质工程

第十六章,基,基因工程,和,和蛋白质工,程,程简介,第一节DNA重组,与,与基因工程,第二节蛋白质工程,简,简介,第三节核酸研究技,术,术简介,返回,第一节,DNA,重组和基因,工,工程,基因工程亦,称,称遗传工程,，,，即利用DNA重组技,术,术的方法，,把,把DNA作,为,为组件，在,细,细胞外将一,种,种外源DNA（目的基,因,因）和载体DNA重新,组,组合连接（,重,重组），最,后,后将重组体,转,转入宿主细,胞,胞，使外源,基,基因DNA,在,在宿主细胞,中,中，随细胞,的,的繁殖而增,殖,殖（cloning，,克,克隆），或,最,最后得到表,达,达，最终获,得,得基因表达,产,产物或改变,生,生物原有的,遗,遗传性状。,一、DNA,重组的技术,路,路线,二、基因工程的,应,应用与前景,三、DNA,体,体外重组常,用,用的酶,返回,DNA,重组的 技,术,术路线,Foreign DNA to be inserted,Plansmid vector,Joining,Recombinant DNA molecule,Introduction into host cells by transformation of viral infection,Host chromateme,Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule,Cloning,+,1、目的基,因,因的制备2、载体的构建3、目的基,因,因与载体的,重,重组4、重组,体,体导入宿主细胞进,行,行扩增5、克隆基因的,鉴,鉴定,Ti质粒结,构,构,植物冠瘿瘤,pBR322,质粒的结构,以,噬菌体为载,体,体进行DNA克隆,DNA,用限制性内,切,切酶除去中,间,间一段,与外源DNA连接,重组载体的,体,体外包装,带有外源DNA的,噬菌体,太小不能被,包,包装,头部前体,多联体DNA,A,蛋白,COS,COS,COS,成熟的颗粒,在宿主细胞内进行DNA的装配过程,噬菌体感染,大,大肠杆菌的,途,途径,DNA重组,体,体的筛选,载体特征的,直,直接筛选,菌落的原位,杂,杂交,免疫学方法,pBR322,质粒结构,如果外源DNA插,入,入，氨卞,青,青霉素抗,性,性基因失,活,活,如果外源DNA插,入,入，四环,素,素抗性基,因,因失活,原位杂交,法,法筛选DNA重组,体,体图解,复印至硝,酸,酸纤维素,膜,膜上,用NaOH菌体裂,解,解DNA,变,变性,杂交,放射自显,影,影,32,P-cDNA,与放射性cDNA,杂,杂交的菌,落,落的斑点,细菌菌落,单链DNA结合到,膜,膜上,Southern,印迹法,DNA分,子,子,限制片段,限制性酶,切,切割,琼脂糖电,泳,泳,转移至硝,酸,酸纤维素,膜,膜上,与放射性,标,标记DNA探针杂,交,交,放射自显,影,影,带有DNA片段的,凝,凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液,转,转移DNA,吸附有DNA片段,的,的膜,Southern,和,和Western,印迹法,DNAfrangment,Electrophoresis,TransferofDNAby blotting,32,P-labledDNAprobe,Autoradiography,Agarrosegel,Autoradiogram,Nitrocellulosesheet,Autoradiogram,Polymersheet,SDS-Polyacrylamide gel,Transferprotein,Addradiolabledspesficantibody,Washto remove unboudantibody,Proteinbanddetected byspecific antibody,Autoradiography,DNA重,组,组技术的,应,应用,(1),开,开辟生物,学,学研究的,新,新纪元,反向生物,学,学（invesebiology,）,）的诞生,（2）促,进,进生物技,术,术产业的,兴,兴起,基因药物,基因诊,断,断和治疗,转基因动,植,植物,胰岛素原,的,的人工合,成,成,胰脏,(A)n,胰岛素原mRNA,cDNA,重组质粒,转化细菌,mRNA,反转录酶,胰岛素原,基,基因,与质粒连,接,接,感染E.coli,胰岛素原,Ti,质粒为载,体,体的植物,基,基因工程,I,二,二元载体,系,系统,II,共整合载,体,体,IIIT-DNA,的转移与,整,整合,Ti,辅助质粒,Ti,辅助DNA给体质,粒,粒,Ti,辅助DNA给体质,粒,粒,pBR型,质,质粒（,给体质粒,）,）,宿主特异,性,性,外源基因,宿主特异,性,性,整合,带有外源,基,基因的Ti,质粒,植物DNA,Ti,质粒转移,并,并插入植,物,物DNA,第二节,蛋,蛋,白,白质工程,简,简介,蛋白质技术和核,酸,酸技术的,相,相互增强,在广泛利,用,用自然界,存,存在的各,种,种蛋白质,的,的过程中,发,发现。这,些,些蛋白质,只,只是适应,生,生物自身,的,的需要，,而,而对于它,们,们的产业,化,化开发往,往,往并不合,意,意，需要,加,加以改造,。,。1983年美国,基,基因公司,的,的Ulmer首先,提,提出蛋白,质,质工程这,个,个名词，,它,它是指按,照,照特定的,需,需要，对,蛋,蛋白质进,行,行分子设,计,计和改造,的,的工程。,自,自此之后,，,，蛋白质,工,工程迅速,发,发展，生,物,物工程的,重,重要组成,部,部分。,蛋白质工,程,程首先是,以,以蛋白质,的,的结构为,基,基础，通,过,过蛋白质,一,一级结构,、,、晶体结,构,构和溶液,构,构象的研,究,究，积累,成,成千上万,蛋,蛋白质一,级,级结构和,高,高级结构,的,的数据资,料,料,，然后按,照,照蛋白质,形,形成的规,律,律，经周,密,密的分子,设,设计，改,造,造蛋白质,或,或构建新,的,的蛋白质,。,。,研究得多,，,，取得成,果,果最显著,的,的是生物,技,技术药（,激,激素、细,胞,胞因子、,酶,酶、酶的,激,激活剂、,受,受体和配,体,体、细胞,毒,毒素和杀,菌,菌肽以及,抗,抗体等）,和,和工业用,酶,酶的蛋白质工,程,程。,生物酶工,程,程示意图,酶的蛋白,质,质结构功,能,能,新酶分子,蓝,蓝图,选择性修,饰,饰方案,突变酶,新酶,克隆酶,产品,效用,发展,酶基因,遗传设计,遗传修饰,DNA,重组技术,DNA,重组技术,蛋白质技,术,术和核酸,技,技术的相,互,互增强,插入表达,载,载体,转化寄主,细,细胞,推导出AA顺序,制备合成,肽,肽,制备对所,编,编码蛋白,专,专一的抗,体,体,基因或cDNA,蛋白质,蛋白质,测定出AA顺序,合成cDNA探针,制备专一,的,的抗体,沉淀核糖,体,体分离mRNA,用Southern印迹法,筛,筛选DNA文库,基因或cDNA,第三节,核,核酸研,究,究技术简,介,介,一、DNA序,列,列测定,二、基因文库,与,与cDNA文库,三、聚合酶链,式,式反应（,polymerase chainreaction,PCR）,DNA测,序,序的基本,战,战略,设法产生,带,带标记的,不,不同长度,的,的成套DNA片段,，,，各带有,标,标记的片,段,段起点相,同,同、终点,不,不同，使,待,待测的DNA链中,的,的相应每,个,个核苷酸,处,处都有断,裂,裂或终止,。,。通过PAGE电,泳,泳，能够,将,将相差一,个,个核苷酸,的,的DNA,片,片段分开,，,，放射自,显,显影后，,根,根据长短,排,排列，根,据,据特定末,端,端碱基的DNA片,段,段就可读,出,出待测DNA的碱,基,基序列。,酶法化学法测序技术,进,进展,酶法序列,分,分析的原,理,理,酶反应,电泳方向,模板,CCGGTAGCAACT,3,5,GG,5,3,引物,dATPdCTPdGTPdTTP,+,ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+,ddTTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+,ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+,ddCTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,GGC,GGCC,GGCCATC,GGCCATCGTTG,GGCCATCG,GGCCAT,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,ACGT,AGTTGCTACC,3,5,TCAACGATGG,5,3,读出模板互补序列,读出模板序列,GGCCATCGTTGA,GGCCATCGT,GGCCATCGTTG,GGCCATCGTT,GGCCATCG,GGCCATC,GGCCA,GGCCAT,GGCC,GGC,DNA的Sanger测序,法,法(酶,法,法),读出模板互补序列,dNTP,凝胶电泳,较大片段,较小片段,ddGTP,ddATP,ddCTP,ddTTP,反应混合,物,物,Klenow,酶,未知序列,的,的单链DNA,读出待测序列,CTGACTTCGACAAAGAA,5,3,放射性标记的引物,TGTT,A C T G,ddG,ddG,ddG,ddG,GACTGAAGCTGTT,3,5,CTGACTTCGACAA,5,3,DNA的,测,测序仪示,意,意图,computeranalysis,凝胶中DNA移动,方,方向,样品槽,激光器,输入光学,系,系统,成象透镜,聚焦透镜,高灵敏度,相,相机,旋光镜/,棱,棱镜组件,DNA的,化,化学测序,示,示意图,反应试剂,G反应：,硫,硫酸二甲,酯,酯,G+A反,应,应：甲酸,T+C反,应,应：肼,C反应：NaCl+肼,测序技术,进,进展,同位素标,记,记到荧光,标,标记,平,板,板电泳到,毛,毛细管电,泳,泳,多色荧光,标,标记,毛细管电,泳,泳,单色荧光,标,标记,平板电泳,同位素标,记,记,平板电泳,A,C,G,T,A,C,G,T,测序图谱,TATTGCAT TGTCTGCATTGTCT,引物标记,法,法测序(DyePrimer),一个样本,，,，4个反,应,应。4个,反,反应中引,物,物序列相,同,同，但分,别,别标记有,不,不同颜色,的,的荧光。,+,AmpliTaq FS enzyme,dCTP,dATP,dGTP,dTTP,dd,A,TP(terminator),+,AmpliTaq FS enzyme,dCTP,dATP,dGTP,dTTP,dd,C,TP,+,AmpliTaq FS enzyme,dCTP,dATP,dGTP,dTTP,dd,G,TP,+,AmpliTaq FS enzyme,dCTP,dATP,dGTP,dTTP,dd,T,TP,反应结束,后,后，将4,管,管反应液,混,混合，经,乙,乙醇沉淀,后,后上样,终止法测,序,序(Dye Terminator),一个样本,，,，1个反,应,应。反应,中,中包含分,别,别带4色,荧,荧光标记,的,的ddNTP(终,止,止子),unlabeled primer,template DNA,+,AmpliTaq FS,dATP,dCTP,dGTP,dTTP,ddCTP,ddATP,ddGTP,ddTTP,测序反应,结,结束后，,采,采用乙醇,沉,沉淀法进,行,行纯化，,除,除去过量,的,的ddNTP后上,样,样。,三基因,文,文库与cDNA文,库,库,1基因文库（genomiclibrary,）,）,cDNA,文,文库（complemental DNA library）,2.文库的构,建,建,基因文库,基,因,因,文,文,库,库,是,是,指,指,整,整,套,套,由,由,基,基,因,因,组,组DNA,片,片,段,段,插,插,入,入,克,克,隆,隆,载,载,体,体,获,获,得,得,的,的,分,分,子,子,克,克,隆,隆,之,之,总,总,和,和,。,。,应,应,用,用DNA,重,重,组,组,技,技,术,术,，,，,可,可,以,以,将,将,各,各,种,种,生,生,物,物,体,体,全,全,部,部,基,基,因,因,组,组,的,的,遗,遗,传,传,信,信