CRISPR基因编辑技术PPT课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,-,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,-,*,基因组编辑技术,姓名：,学号：,1,-,自从证明,DNA,是遗传物质以后，人类就开始了通过改变,DNA,来改造生物体生理机理和功能的尝试。,1973,年，斯坦利,N,科恩,(Stanley N. Cohen),和赫伯特,W,博耶,(Herbert W. Boyer),成功将蛙的,DNA,插入到细菌中。,20,世纪,70,年代，基因泰克,(Genetech),公司对大肠杆菌进行基因改造，使其带有一个人源基因,(,这个基因是人工合成的,),，最后生产出治疗糖尿病的胰岛素。,1974,年，加利福尼亚州索克生物研究所,(Salk Institute for Biological Studies),的,Rudolf Jaenisch,通过将,SV40,病毒的,DNA,注射到小鼠的囊胚中,培育出了第一只转基因小鼠。,2,-,基因突变技术：物理诱变、化学诱变,转基因技术：,T-DNA,插入,RNA,干扰技术：,dsRNA,、,Artificial miRNA,核外遗传技术：质粒、人工染色体,同源重组技术：,e.g.,传统的基因敲除小鼠,无法控制突变位点,不能精确控制外源基因插入位点,对靶基因抑制不彻底、不特异,难以稳定的遗传,费时费力费钱，难以大量应用,并引起一系列生物伦理的问题,现 状,3,-,4,-,基因组编辑技术,基因组编辑技术（,genome editing,）,是一种可以在基因组水平上对,DNA,序列进行改造的遗传操作技术。也称为基因打靶（,Gene targeting,）。,技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断,DNA,，切断的,DNA,在被细胞内的,DNA,修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。,5,-,历史,1993,年前,ZFN,就已开始出现，迄今已发展了,20,多年才有今天的成就；,2009,年底出现的,TALEN,似乎一夜之间呈现出取代,ZFN,的架势；,2012,年底,CRISPR/Cas,已显现出取代,TALEN,的巨大潜力，在,2013,年成为现实。,荣誉,2011,年：,ZFN,，,TALEN,和,Meganuclease2011,年度方法（,Nature Methods,）,2012,年：,TALEN 2012,年十大突破（,Science,）,2013,年：,CRISPR/Cas,被认为是诺贝尔奖级别的成果，华人科学家张峰已因此获得生物医学大奖。,基因组编辑技术,应用,基因组巡航导弹，分子剪刀，,DNA,外科医生,定点突变，定点修饰（包括得到转基因），转录调控,基因治疗（如遗传病）,6,-,基因编辑的三大利器,ZFN,(Zinc-finger nucleases, ZFN),TALEN,（,transcription activator-like effector nucleases),CRISPR/Cas,(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases,）,特异性,DNA,识别域,非特异性,核酸内切酶,+,7,-,ZFN原理,ZFN=蛋白的DNA识别域+核酸内切酶,DNA识别域：,由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般34个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。,8,-,核酸内切酶：,非特异性核酸内切酶FokI，,形成二聚体时,切割双链DNA,两条,ZFN,之间具有被称为“间隔区”的,spacer,结构，该结构的长度以,5,6bp,为宜，,7bp,也能正常工作，合理的“间隔区”设计才能保证,ZFN,二聚体拥有最佳的工作空间。,9,-,ZFN,技术的缺陷,DNA,识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但是其,识别的序列长度比较有限,。,因为,ZFN,剪切的过程,不完全依赖同源二聚体的形成,，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成,脱靶效应,；,如果出现脱靶，可能导致,DNA,的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。,另一方面，该手段在细胞内部操作的精确程度不足，则可能会引起相关基因突变，引发癌症等。,ZFN,作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会,引发免疫反应,。而现有的研究手段尚不能预测引入的,ZNF,蛋白是否会引起免疫系统的进攻。,到目前为止，,ZFN,技术只能用于体外操作（,in vitro,），在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。,10,-,TALEN,TALEN,（,Transcription activator -like effectors,）,:,一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。,科学家发现，来自植物细菌,Xanthomonas sp. (,黄单胞菌,),的,TAL,蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。,通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。,目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。,11,-,TALEN原理,典型的,TALEN,由一个包含,核定位信号,（,NLS,）的,N,端结构域、一个包含可识别特定,DNA,序列的典型,串联,TALE,重复序列,的中央结构域，以及一个具有,FokI,核酸内切酶,功能的,C,端结构域组成。,DNA识别域：,由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识,别并结合一个对应的碱基。,核酸内切酶：,非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA,12,-,全长为,34aa,的,Tal,蛋白的第,12,、,13,位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基,。,NG,可以识别,T,HD,可以识别,C,NI,可以识别,A,NN,可以识别,G,或,A,通过这种特异性识别，将多个,Tal,蛋白组装在一起，就可以构成可以识别目的片段的,Tale,蛋白。,TALEN原理,13,-,TALEN,的特异性打靶的原理：,一对可以特异性识别靶基因的,TALE,，定位到需要编辑的基因组区域；,然后非特异性核酸内切酶,FokI,切断双链,DNA,从而造成,DNA,双链断裂（,double-strand break,，,DSB,）；,再通过,DNA,的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。,FokI,只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。,TALEN原理,14,-,TALEN介导的基因编辑,TALEN,质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个,TALEN,融合蛋白中的,Fok I,临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切,DNA,。,形成,DSB,时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。,15,-,TALEN的技术特点,任意敲除,，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活,成功率高,，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上,打靶效率高,，可完全替代RNAi技术,脱靶率低,，尚未发现明显脱靶效应,技术简单,，只需按照常规构建质粒方法构建,Talen,质粒,16,-,CRISPR/Cas 9 背景,CRISPR,是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌内，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列(既,CRISPR,序列)和,CRISPR,相关基因，这一序列首先由日本学者于,1987,年首次发现,(1),，于,2002,年被,Jansen,等将正式命名,(,。,17,-,CRISPR-Cas,系统简介,CRISPR-Cas,系统的研究历史,1987,年，日本课题组在,K12,大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。,2002,年，正式将其命名为,成簇的规律间隔的短回文,重复序列,2005,年发现,CRISPR,的间隔序列,(spacer),与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过,CRISPR,系统可能以类似于真核生物的,RNAi,方式抵抗外源遗传物质的入侵。,2007,年，,Barrangou,等首次发现细菌可能利用,CRSPR,系统抵抗噬菌体入侵；,2008,年，,Marraffini,等发现细菌,CRISPR,系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了,CRISPR,系统的功能,2013,年初，,MIT,的研究组首次利用,CRISPR/Cas9,系统对人,293T,细胞,EMX1,和,PVALB,基因以及小鼠,Nero2A,细胞,Th,基因实现了定点突变。同年,Mali,利用,CRISPR/ Cas9,在人,293T,细胞和,K652,细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的,DNA,修复机制高效介导外源基因定点插入。,18,-,由这些序列和基因组成的系统我们称之为,CRISPR/Cas,系统，而在这个系统中常用到的核酸内切酶为,Cas9,所以通常称该系统,CRISPR/Cas9,系统。利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。,CRISPR/Cas 9 背景,19,-,CRISPR/Cas 9概述,CRISPR-Cas,：一种来源是细菌获得性免疫的由,RNA,指导,Cas,蛋白对靶向基因进行修饰的技术。,20,-,CRISPR-Cas,系统的结构,CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的,重复序列R,( repeat) 与长度相似的,间区序列S,( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，,前导序列L,( leader) 以及一系列,CRISPR 相关蛋白基因,cas。,Cas蛋白是一种双链,DNA,核酸酶，能在,guide RNA,引导下对靶位点进行切割。它与,folk,酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,21,-,CRISPR/Cas系统的基本结构,识别作用,切割作用,CRISPR,系统通常包括：由不连续的重复序列（,repeats，R,）与长度相似的间区序列（,spacers，S,）间隔排列而成的CRISPR簇，前导序列(,leader，L),以及一系列的,CRISPR,相关蛋白基因(cas)。,Cas（CRISPR associated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它不需要形成二聚体才能发挥作用。,22,-,CRISPR的转录与加工,CRISPR簇首先转录成长的转录体，即（crRNA），然后逐步被加工成小的 crRNA。,23,-,CRISPR/Cas 9作用机理,24,-,CRISPR/Cas 9作用机理,PAM（NGG序列）,25,-,CRISPR/Cas 9系统靶向要求,最主要的要求：,PAM,（,protospacer-adjacent motif,）为,NGG,。在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。,26,-,CRISPR/Cas 9基因编辑实验流程图,27,-,CRISPR/Cas 9的技术应用,应用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。,能够在真核细胞中发挥作用，使真核基因组中的特异性位点发生双链断裂。,在模式生物中的应用:成功地对线虫(左)、斑马鱼胚胎（中）和果蝇进行遗传学改造，获得更粗短的线虫，腹部组织体积更大的斑马鱼胚胎，和眼睛颜色更深的果蝇，表明,CRISPR,技术在动物基因改造方面有巨大应用潜力。,中国科学院遗传所高彩霞团队：成功地使三种水稻基因失活。,28,-,近日，中国科学家利用基因编辑技术,CRISPR/Cas9,，对抑制狗骨骼肌生长的基因（,MSTN,）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。,CRISPR/Cas 9的技术应用,29,-,三大基因修饰技术比较,30,-,CRISPR/Cas 9系统的优势,操作简单，靶向精确性更高。,sgRNA,靶向序列和基因组序列必须完全匹配，,Cas9,才会对,DNA,进行剪切。编码,sgRNA,的序列不超过,100bp,，因此比构建,TALENs,和,ZENs,更简单方便，用于,CRISPR,的,sgRNA,识别序列仅需20个核苷酸。,CRISPR/Cas9,系统是由,RNA,调控的对,DNA,的修饰，其基因修饰可遗传。,基因修饰率高，,CRISPRs,基因敲入的效率为,51%-79%,，,TALENs,的效率为,0%-34%,。,基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等,无物种限制,可实现对靶基因多个位点同时敲除。,实验周期短，最快仅需,2,个月，节省大量时间和成本。(ZFNS一个靶点成本6000),31,-,CRISPR/Cas 9系统的评价,32,-,参考文献：,1 Y. Ishino, H. Shinagawa, K. Makino, M. Amemura, A. Nakata, Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology 169, 5429-5433 (1987).,2 R. Jansen, J. D. A. v. Embden, W. Gaastra, L. M. Schouls, Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology 43, 1565-1575 (2002).,3方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术J. 生物化学与生物物理进展,2013,08:691-702.,4李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞. CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术J. 遗传,2013,11:1265-1273.,5沈彬. 利用CRISPR/Cas9进行基因编辑D.南京大学,2014.,谢谢欣赏,欢迎批评指正,33,-,