三少__基因工程的基本操作步骤

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/2/8,#,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,有了目的基因，我们才能赋予一种生物另一种生物的遗传特性,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,基因是什么结构,?,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上,游有启动子，下游有终止子,启动子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合酶,结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：,有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,基因是什么结构,?,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,(1)从基因文库中获取目的基因,什么是基因文库？,什么是基因组文库？,什么是部分基因文库？,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,概念：,基因文库,（gene library）,基因组文库,部分基因文库,（如cDNA文库）,将含有某种生物不同基因的,许多DNA片段,导入,受体菌,的群体中储存,各个,受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library),基因组文库:,基因文库中,包,包含了一种,生,生物所有的基因,这种基因,文,文库叫做基,因,因组文库.,部分基因文,库,库:,基因文库中,包,包含了一种,生,生物的一部分基因,这种基因,文,文库叫做部,分,分基因文库.,提取某种生,物,物的全部DNA,用适当的限,制,制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片,段,段与载体连,接,接,导入受体菌,中,中储存,基因组文库,基因文库的,构,构建方法,（1）直接,分,分离法(鸟,枪,枪法),某种生物的,单,单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌,中,中储存,与载体连接,cDNA文,库,库,反（逆）转,录,录酶,DNA聚合,酶,酶,（2）反（,逆,逆）转录法,：,：cDNA,的,的合成流程,图,图解,基因文库的,构,构建方法,某种生物某,个,个时期的mRNA,cDNA,反转录,受体菌群体,与运载体连接 导入,cDNA文,库,库,一、目的基,因,因的获取,1、目的基,因,因主要是指_,编码蛋白质,的,的结构基因,请举出三个,以,以上的例子,2、获取目,的,的基因的常,用,用方法,（1）从基,因,因文库中获,取,取,（2）利用PCR技术,扩,扩增,利用PCR,技,技术扩增目,的,的基因,PCR,聚合酶,链,链式反应,是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸,合,合成技术。通过此技,术,术，可获取,大,大量的目的,基,基因。,PCR技术,原理：,前提：,原料,方式,PCR扩增,仪,仪,DNA复制,一段已知目,的,的基因的核,苷,苷酸序列,：以_方式扩,增,增，,即_,（,（n为扩增,循,循环的次数,）,）,指数,2,n,模板DNA,；,；DNA引,物,物；四种脱,氧,氧核苷酸；,热,热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,过程,变性、退火,、,、延伸三步,曲,曲,变性：,加热至,90,95,双链DNA,解,解链成为单,链,链DNA,退火：,冷却至,55,60,部分引物与,模,模板的单链DNA的特,定,定互补部位,相,相配对和结,合,合,延伸：,加热至,70,75,以目的基因,为,为模板，合,成,成互补的新DNA链,变性,退火,延伸,2、具体过,程,程,一、目的基,因,因的获取,1、目的基,因,因主要是指_,编码蛋白质,的,的结构基因,基因是什么,结,结构?,2、获取目,的,的基因的常,用,用方法,（1）从基,因,因文库中获,取,取,（2）利用PCR技术,扩,扩增,（3）人工,合,合成,人工合成,根据已,知,知的氨基酸,序,序列合成DNA,蛋白质的氨,基,基酸序列,mRNA的,核,核苷酸序列,结构基因的,核,核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,1、目的基,因,因的获取,2、基因表,达,达载体的构,建,建,基因工程基,本,本操作的四,个,个步骤,使目的基因,在,在受体细胞,中,中稳定存在,，,，并可进行,遗,遗传、表达,和,和发挥作用,3、将目的,基,基因导入受,体,体细胞,4、目的基,因,因的检测与,鉴,鉴定,二、基因表,达,达载体的构,建,建核心,（1）用一,定,定的_切割质粒,，,，使其出现,一,一个切口，,露,露出_。,（2）用_,切,切断目,的基因，使,其,其产生_,_。,（3）将切,下,下的目的基,因,因片段插入,质,质粒的_处,，,，再加入适,量,量_，形成,了,了一个重组,DNA分子,（,（重组质粒,）,）,限制酶,黏性末端,同一种限制,酶,酶,的黏性末端,切口,DNA连接,酶,酶,相同,1.过程:,基因表达载,体,体的构建,核心,质粒,DNA分子,一个切口,两个黏性,末,末端,两个切口,获得,目,目的,基,基因,DNA,连,连接,酶,酶,重组DNA分,子,子（,重,重组,质,质粒,）,）,同一,种,种,限,限制,酶,酶,目的,基,基因,与,与运,载,载体,的,的结,合,合过,程,程，,实,实际,上,上是,不,不同,来,来源,的,的基,因,因重,组,组的,过,过程,。,。,2、基因表达载体的作用,a、,使,使目,的,的基,因,因在,受,受体,细,细胞,中,中稳定,存,存在并遗传,给,给子,代,代,b、,同,同时,使,使目,的,的基,因,因能表达,和,和发,挥,挥作,用,用,思考,：,：,作为,基,基因,工,工程,表,表达,载,载体,，,，只,需,需含,有,有目,的,的基,因,因就,可,可以,完,完成,任,任务,吗,吗？,为,为什,么,么？,基因,表,表达,载,载体,的,的组,成,成：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于,基,基因,的,的首,端,端,是,是mRNA聚,合,合酶,结,结合,位,位点,位于,基,基因,的,的末,端,端,终,终止,转,转录,检测,目,目的,基,基因,是,是否,导,导入,受,受体,细,细胞,它们,有,有什,么,么作,用,用？,1、,目,目的,基,基因,的,的获,取,取,2、,基,基因,表,表达,载,载体,的,的构,建,建,3、,将,将目,的,的基,因,因导,入,入受,体,体细,胞,胞,基因,工,工程,基,基本,操,操作,的,的四,个,个步,骤,骤,载体,进,进入,受,受体,细,细胞,稳,稳定,表,表达,，,，才,能,能实,现,现一,种,种生,物,物的,基,基因,在,在另,一,一种,生,生物,中,中的,转,转化,。,。,常用,的,的受,体,体细,胞,胞：,有大,肠,肠杆,菌,菌、,枯,枯草,杆,杆菌,、,、土,壤,壤农,杆,杆菌,、,、酵,母,母菌,和,和动,植,植物,细,细胞,等,等。,将目,的,的基,因,因导,入,入受,体,体细,胞,胞的,原,原理,借鉴细菌,或,或病,毒,毒侵,染,染细,胞,胞的途,径,径。,三、,将,将目,的,的基,因,因导,入,入受,体,体细,胞,胞,1、,将目,的,的基,因,因导,入,入植,物,物细,胞,胞,（1,）,）农,杆,杆菌,转,转化,法,法,特点:,能感,染,染双子,叶,叶植,物,物和祼子,植,植物,对,单,单子,叶,叶植,物,物无,感,感染,能,能力,Ti,质,质粒的T,DNA,可,可转,移,移至,受,受体,细,细胞,并,并整,合,合到,其,其染,色,色体,上,上,转化,过,过程:,Ti,质,质粒,目的,基,基因,构建,表达,载,载体,导入,植物,细,细胞,插入,植物,细,细胞,染,染色DNA,表达,新性,状,状,转入,农杆,菌,菌,（2,）,）基,因,因枪,法,法,基因,枪,枪法,又,又称,微,微弹,轰,轰击,法,法，,是,是利,用,用压,缩,缩气,体,体产,生,生的,动,动力,，,，将,包,包裹,在,在金,属,属颗,粒,粒表,面,面的,表,表达,载,载体DNA打,入,入受,体,体细,胞,胞中,，,，使,目,目的,基,基因,与,与其,整,整合,并,并表,达,达的,方,方法,。,。,（3,）,）花,粉,粉通,道,道法,植物,花,花粉,在,在柱,头,头上,萌,萌发,后,后，,花,花粉,管,管要,穿,穿过,花,花柱,直,直通,胚,胚囊,。,。花,粉,粉管,通,通道,法,法就,是,是在,植,植物,受,受粉,后,后，,花,花粉,形,形成,的,的花,粉,粉管,还,还未,愈,愈合,前,前，,剪,剪去,柱,柱头,，,，然,后,后，,滴,滴加DNA（,含,含目,的,的基,因,因）,，,，使,目,目的,基,基因,借,借助,花,花粉,管,管通,道,道进,入,入受,体,体细,胞,胞。,2、,将,将目,的,的基,因,因导,入,入动,物,物细,胞,胞,方法,：,：显,微,微注,射,射法,程序,：,：,目的,基,基因,表,表达,载,载体,提,提纯,取,取卵,（,（受,精,精卵,）,）,显,显微,注,注射,受,受精,卵,卵,新,新性,状,状动,物,物,3、,将目,的,的基,因,因导,入,入微,生,生物,细,细胞,常用,法,法：Ca,2+,处理,常用,菌,菌：大,肠,肠杆,菌,菌,微生,物,物作,受,受体,细,细胞,原,原因,：,：,繁殖,快,快、多,为,为单,细,细胞,、,、遗,传,传物,质,质相,对,对少,过程,：,：,Ca,2+,处理,大肠,杆,杆菌,感受,态,态细,胞,胞,表达,载,载体,与,与感,受,受态,细,细胞,混,混合,感受,态,态细,胞,胞吸,收,收DNA,1、,目,目的,基,基因,的,的获,取,取,2、,基,基因,表,表达,载,载体,的,的构,建,建,3、,将,将目,的,的基,因,因导,入,入受,体,体细,胞,胞,4、,目,目的,基,基因,的,的检,测,测与,鉴,鉴定,基因,工,工程,基,基本,操,操作,的,的四,个,个步,骤,骤,才能,确,确定,目,目的,基,基因,是,是否,真,真正,在,在受,体,体细,胞,胞中,稳,稳定,遗,遗传,和,和正,确,确表,达,达。,四、,目,目的,基,基因,的,的检,测,测与,鉴,鉴定,检测,导,入,入检,测,测：,目,目的,基,基因,是,是否,导,导入,受,受体,细,细胞,方法,DNA分,子,子杂,交,交,表,达,达检,测,测,转录,检,检测,分,分子,杂,杂交,翻译,检,检测,抗原,抗,抗体,杂交,分子,检,检测,法,法,鉴定,抗虫,鉴,鉴定,抗病,鉴,鉴定,活性,鉴,鉴定,等,等,个体,水,水平,的,的鉴,定,定,