实验一、RNA提取及检测

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验,一、,RNA,提取及检测,一、实验目的,掌握植物,RNA,RNA,提取及检测方法,二、实验试剂及材料,水稻叶片、液氮、,Trizol,试剂、氯仿、异丙醇、,DEPC,水,三、实验器材,恒温水浴锅、,PCR,仪、台式低温离心机、移液枪、研钵、紫外分光光度计，一次性手套。,四、实验步骤,采用,Trizol,法提取,RNA(50,100mg,组织,ml trizol),，以加,1ml Trizol,为例，操作流程如下：,(1),研钵加液氮数次至足够冷，加入样品，研磨至粉末。加入,Trizol,（每,100mg,组织加,1ml,的,Trizol,），充分研磨，放在室温下解冻。,(2),除不溶性物质：,2,8,C,下,12000g,离心,10min,，不溶性物质沉淀，将,RNA,的上清移入,1.5 ml,离心管中。,(3),相分离：在,15,30,下放置,5min,，使核蛋白复合物完全解离。加,0.2ml,氯仿，剧烈振荡,15 sec,，室温下温浴,2,3min,。,2,8,下，,12000g,离心,15min,，,RNA,全部溶解于上层水相中，把水相移入另一,1.5ml,离心管中。,(4),氯仿再次去杂：加,0.5ml,氯仿，剧烈振荡,15sec,，室温下温浴,2,3min,；,2,8,下，,12000g,离心,15min,，把水相转入,1.5ml,离心管中。,(5),RNA,沉积：加入,0.5ml,异丙醇，,15,30,温浴,10min,；,2-8,下，,12000g,离心,10min,，,RNA,沉积在离心管的底部及侧壁。,(6),清洗,RNA,：加入,1ml 75%,乙醇，,2,8,下,7500g,离心,5min,，小心将上清液倒掉。,(7),再清洗：加入,1ml 75%,乙醇，,2,8,下，,7500g,离心,5min,，小心将上清液倒掉。,(8)RNA,的溶解：将离心管倒扣在吸水纸上,5,10min,，每管加,30l,的,DEPC,水，可在,55,60,下助溶,10min,。,(9)RNA,浓度：用,DEPC,水稀释,100,倍，用紫外分光光度计 测定,OD,值（,260nm,、,280nm 230nm,），估算,RNA,浓度。,-70 ,保存。,总,RNA,定量方法,RNA,在,260nm,波长处有最大吸收峰。,OD,值为,1,相当于大约,40g/ml,的单链,RNA,。如用,1cm,光径，用,ddH2O,稀释,DNA,样品,n,倍并以,ddH2O,为空白对照，根据此时读出的,OD260,值即可计算出样品稀释前的浓度：,RNA,（,mg/ml,）,=40OD260,读数,稀释倍数,(n)/1000,RNA,浓度检测过程,（,1,）取少量待测,RNA,样品，用,DEPC,水,稀释,100,倍。,（,2,）用,DEPC,水,做空白，在,260 nm,、,280 nm,、,230 nm,处调节紫外分光光度计的读数至零。,（,3,）加入待测,RNA,样品在三个波长处读取,OD,值。,RNA,纯品的,OD260/OD280,的比值为,2.0,，故根据,OD260/OD280,的比值可以估计,RNA,的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示,RNA,有降解。,OD260/OD230,比值应,2.0,，若比值较低说明盐分过高。,电泳检测,RNA,质量：,（,1,）配制,1.2%,的琼脂糖凝胶（,20mL,）,称取琼脂糖,0.24 g,，加,DEPC,处理的,ddH2O 12.04 mL,，,5RNA,电泳缓冲液,4 mL,，电炉加热融化琼脂糖，冷却至,55C,，加入甲醛,1.96 mL,，冷却后倒胶。,（,2,）,RNA,电泳,取去离子甲酰胺,10 L,，甲醛,1.5 L,，,10 RNA Buffer 2 L,，,RNA (2,4 g, 10 L),混合液，,65C,加热,15min,，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入,3 L RNA,加样缓冲液和,0.5 L EB,，上样电泳。电泳,Buffer,为,1 RNA buffer,。,（,2,）,RNA,电泳结果判别质量：,出现的电泳条带有两条，是两条最大的核糖体,RNA,（,rRNA,）分子，即,18S,和,28S rRNA,，较小的,RNA,也很丰富但看不到，因为太小，跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使,RNA,（,mRNA,）经,EB,染色后不足以形成可见的带。只要,18S,和,28SrRNA,带亮，且,28S rRNA,大约为,18S rRNA,的两倍，说明提取的,RNA,没有发生降解，纯度好。,五、总,RNA,提取常见问题分析,RNA,降解,1,、,外源,RNA,酶的污染,：,试剂，器械及实验环境中的,RNA,酶进入实验系统。,2,、,内源,RNA,酶的污染,：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。,3,、,外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足,。,如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至,-70,冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于,-70,冰箱中。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷。,OD260/OD280,比值偏低,1.,蛋白质污染,：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得,RNA,的,OD260/OD280,比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。,2.,苯酚残留,：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,3.,多糖或多酚的残留,：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致,OD260/OD280,比值偏低。因此，从这类材料中提取,RNA,时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。,4.,设备限制：,测定,OD260,及,OD280,数值时，要使,OD260,读数在,之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测,OD,值时，对照及样品稀释液请使用,10mM Tris,，,pH7.5,。用水作为稀释液将导致比值偏低。,RNA,提取得率低,1.,该组织或者细胞中,RNA,含量偏低,：,不同细胞和组织中,RNA,的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织,(,总,RNA,含量,2-4g/mg),，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织,(,总,RNA,含量,0.05-2g/mg),，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织,(,总,RNA,含量,0.05g/mg),。,2.,组织起始量太少或者太多：,样品量过少，则细胞组织中,RNA,含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致,RNA,得率低。,六、,注意事项：,1,所有实验过程均须避免,Rnase,的污染。,2,要避免沉淀完全干燥，否则,RNA,难以溶解。,3.,样品量和,Trizol,的加入量一定要按步骤（,1,）的比例，不能随意增加样品量或减少,Trizol,量，否则会使内源性,RNase,的抑制不完全，导致,RNA,降解。,