细胞培养技术实用篇示范课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,细胞培养技术实用篇,细胞培养的优点,活细胞长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构和生命活动,可控制,选择特定的细胞种类、性质、阶段,可控制调节条件物理、化学、生物等,可采用各种研究技术、记录方法,样品均一性来源于同一组织同一种细胞,经济、规模,局限性,人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同,缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响,体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环境中，必然发生变化。,本章主要内容,细胞培养的基本操作技术,原代培养,(primary culture),传代培养,(subculture),体外培养细胞的影响因素,细胞培养污染及对策,培养细胞的生长测定方法,细胞冻存和复苏,细胞培养中的常用术语,组织培养(Tissue Culture) 指的是从体内取出组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。,器官培养（Organ Culture） 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。,细胞培养(Cell Culture) 培养物是单个细胞和细胞群。,细胞培养中的常用术语,原代培养（primary culture）从体内取出细胞或组织的第一次培养。,传代（passage）也称再培养。无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。,细胞系（cell line）原代培养物经首次传代成功后即为细胞系,细胞培养中的常用术语,细胞株（cell strain）通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。,汇合（confluent）细胞相互连接成片占据所有底物面积。,接触抑制（contact inhibition）细胞汇合相互接触后失去运动的现象,一、细胞培养基本操作技术,由于体外培养的,细胞没有抗感染能力，,因此防污染是决定培,养成功的首要条件。,一切操作需要保证,无菌和有条不紊。,培养前准备,制定好实验计划和操作程序,有关数据的计算要事先做好。,准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置在操作场所,(,培养室、超净台,),内，然后开始消毒。,避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。,消毒,地面每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒3050min,超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。,消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。,一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,洗手和着装,原则上和外科手术相同。,仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射,30min,的清洁工作服,在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用,75,酒精消毒手。,进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。,专用鞋或带鞋套,火焰消毒,在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。,按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。,如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，以防烧死细胞。,操作,进行培养时，动作要准确敏捷,不能,太快，,否则,空气流动增加污染机会。,不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。,组织细胞取材及培养的基本要求,取材的组织用培养液浸泡，,4,运送，,24h,内尽快培养。,取材,时应严格,无菌,操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。,原代培养,，特别是正常细胞的培养，应采用,营养丰富,的培养液。,一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养,;,分化低的较分化高的组织容易生长,;,肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用,易培养,的组织进行培养。,为了,便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。,组织材料的分离,机械法适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、胸腺等。剪切组织为1mm3碎块后，置于组织匀浆器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。,化学法胰蛋白酶、胶原酶、EDTA法,细胞悬液的分离方法低速离心法、密度梯度离心法,组织样本原代培养的污染多数来源于组织样本；,不同的细胞对培养基需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。,然后紫外线消毒30min。,如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。,培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。,这种情况下，最好减少细胞接种数，延长换液的时间。,细胞培养(Cell Culture) 培养物是单个细胞和细胞群。,适于分离密度不等的细胞。,有的散在生长，倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列，培养液一般不发生浑浊。,细胞悬液的分离方法低速离心法、密度梯度离心法,减少空气流动是防止污染的重要环节。,3HTdR掺入法和BrdU掺入法,吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡,如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。,神经元胞体呈圆形或长杆状,核大而圆,核仁明显.,数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。,支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的,常用介质有Ficoll 400，Percoll，泛影葡胺等。,细胞质回缩，胞质呈圆球形,对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。,细胞悬液的分离方法,低速离心法 血液和体液等细胞悬液5001000rpm离心510min。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。,密度梯度离心法 用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll 400，Percoll，泛影葡胺等。,胰蛋白酶（,Trypsin,）,对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。,消化效果与,PH,值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关。,适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效但若与胶原酶合用能增加其对组织的分离作用 。,钙镁离子和血清抑制其活性。,常用剂量为,0.25%,，,PH8,，温度,37,胶原酶法（,collagenase,）,水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影响不大。,产品有 等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞及纤维组织。,钙镁离子和血清不影响活性，PH6.57,常用剂量为200U/ml,EDTA,法,EDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。,缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，可与胰蛋白酶混合使用(11或21)，既利于细胞脱壁又利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。,EDTA工作液的浓度为0.02，用不含钙、镁PBS配制。,二、原代培养,(primary culture),从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养，即将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用,EDTA,）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。,原代培养细胞,组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实验的很好对象；,原代细胞培养也是建立各种细胞系（,cell line),或细胞株（,cell strain,）必须经过的阶段。,原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复杂，即使是经过处理后的细胞，也仍具有异质性（,heterogeneous),主要表现在细胞形态和大小不一,原代培养的方法,悬浮细胞培养法,器官培养法,组织块培养法,细胞培养法,悬浮细胞培养法,对于悬浮生长的细胞如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无须消化，可采用低速离心分离,直接培养。,器官培养,(organ culture),指组织、器官原基，以至整个器官或其一部分在体外的维持或生长，它们可以分化与保持原来的结构与功能。,细胞培养法,方法与步骤,1) 动物处死将出生23d乳鼠，,用脱颈方法处死。用酒精棉球,擦拭解剖部位。,2) 取材及剪切在无菌条件下将,组织取出，置于无菌培养皿中，,剪去多余的组织（脂肪等），,用PBS液洗涤12次；放入另一,培养皿中，将组织剪成1mm3大,小的块。,细胞培养法,方法与步骤,3) 消化及分散组织块将上述清洗过的组织放入无菌试管内，加入56倍量的0.25胰蛋白酶液（pH7.4 7.6），置37水浴中消化20 40min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试管，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。,细胞培养法,方法与步骤,4)计数与稀释:从过滤的细胞悬液中取出适量滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含3 5105个细胞为宜。,5)分装与培养将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶 or 培养皿中，盖好，做好标记，置于37 CO2培养箱中培养。,6)观察逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。,对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,噻唑蓝 （MTT）比色法,组织取出，置于无菌培养皿中，,氢化可的松可促进表皮细胞和乳腺上皮细胞生长，并能提高胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率，用量为108 107mol/L。,有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常,有关数据的计算要事先做好。,汇合（confluent）细胞相互连接成片占据所有底物面积。,快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。,另外随着细胞种类增多不同种细胞交叉污染也时有发生、从而造成细胞不纯。,数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。,与抗生素联合应用效果更佳。,3HTdR掺入法和BrdU掺入法,培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。,原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复杂，即使是经过处理后的细胞，也仍具有异质性（heterogeneous),主要表现在细胞形态和大小不一,传代培养(subculture),然后紫外线消毒30min。,由于体外培养的,密度梯度离心法 用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。,如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。,不同的细胞对培养基需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。,4)计数与稀释:从过滤的细胞悬液中取出适量滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数；,细胞培养法,注意事项,取材的组织最好尽快培养,，若不能及时培养，可将组织浸泡于培养液内放置于冰浴或,4,0,C,冰箱。若组织块很大，应先将其切成,1cm2,以下的小块再低温保存，但时间不能超过,24,小时，因放置时间长或组织块太大都易造成细胞的死亡；,取材时严格无菌操作,。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。,3.,取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏死组织等。,修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少量培养液中；,组织块培养法,组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故也被称为组织培养,(tissue culture),。,组织块培养法,(1),取材、修剪、组织剪或切成,1mm,3,左右的小 块。,(2),将 剪切好的组织小块用眼科镊送入培 养 瓶内。,25ml,培养瓶,(,底面积约为,17.5cm,2,）以,20,一,30,小块为宜。,(3),放置,24h,待组织小块贴附后将培养瓶慢慢翻转平放、静止培养,注意事项,组织块接种后l3天，游出细胞数很少,组织块的粘贴不牢固。观察、移动过程中要注意动作轻巧。尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。,在原代培养的12d内要持别注意观察，是否有细菌、霉菌的污染。一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其它细胞带来污染。,原代培养35d需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞，以免影响原代细胞的生长。,几种细胞的原代培养图示,1.,细胞种类：人肺 部 成 纤 维 细 胞 ；,2.,培养的天数：,2d - 4d - 7d;3.,放大倍数：,200,倍 ；,4.,培养基种类：,1640+10%,胎牛血清；,5.,细胞状态与特征简述,:,细胞呈梭形，贴壁生长,;,几种细胞的原代培养图示,1. 细胞种类小鼠胚胎成纤维细胞,2. 培养的天数4d；,3. 放大倍数倒置显微镜 ； 4. 培养基种类1640+10%X小牛血清；,5. 细胞状态与特征简述:细胞呈长梭形，贴壁生长,几种细胞的原代培养图示,神经元原代培养,:,神经元是高度分化的细胞,在体外培养条件下难以增殖,.,因此,目前神经元的培养主要用于原代培养,.,神经元胞体呈圆形或长杆状,核大而圆,核仁明显,.,可见有细小突起从胞体长出,.,培养液中需加入高浓度的葡萄糖,以利于神经元的生长,.,三、传代培养,(passage or subculture),细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。不论是否稀释，将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养,(passage),。,细胞的传代培养,根据细胞生长的特点，传代方法有2种。,悬浮生长细胞传代,离心法传代离心（1000rpm）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。,直接传代法悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l223，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。,细胞的传代培养,贴壁生长细胞传代,采用酶消化法传代。在传代时，需要用胰蛋白酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用EDTA溶液与胰蛋白酶按11或21比例混合后联合使用。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,Optimal confluency for moving cells to a new dish is 7080%,too low, cells will be in lag phase and wont proliferate,Too high and cells may undergo unfavorable changes and will be difficult to remove from plate,吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡,细胞株（cell strain）通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。,二、原代培养(primary culture),25胰蛋白酶液（pH7.,支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的,在培养液中加入适量的抗菌素。,原代细胞第1次换液时，切记不要把培养液全部倒掉。,取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。,因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。,剪去多余的组织（脂肪等），,常用的排除微生物污染的方法有以下4种,一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,细胞株（系）条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进行全量换液。,为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。,EDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。,细胞附着于底物上，游离期结束。,有关数据的计算要事先做好。,几种细胞的原代培养图示,贴壁生长细胞传代方法,酶消化过程,酶消化过程,注意问题,操作全过程注意无菌操作,胰酶消化时间要适度,吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡,贴壁生长细胞的生长过程,游离期,贴壁期,潜伏期,对数生长期,停止期（平台期）,游离期,细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期,细胞质回缩，胞质呈圆球形,10分钟4小时,贴壁期,细胞附着于底物上，游离期结束。,底物胶原、玻璃、塑料等,细胞株平均在10分钟4小时贴壁,血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白。,进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期、对数生长期、停止期,潜伏期细胞有生长活动，而无细胞分裂，细胞株潜伏期一般为624小时。,对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期细胞长满瓶壁，虽有活力但不再分裂，机制为接触抑制、密度依赖性。,四、影响体外培养细胞的因素,组织和细胞供体年龄,培养条件,细胞的粘附,培养技术方法,促生长因子,组织和细胞供体年龄,幼年个体比老年者易于培养，所有动物的胚胎组织都是最好的培养对象。,来自同一个体的组织，分化低的比分化高的容易培养。,培养条件,不同的细胞对培养基需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。应了解所培养细胞的生物学性状和特殊需求成分。,细胞在体外进行培养，失去了机体的调节和控制。因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、气体环境、,PH,值等均能影响细胞的生长,。,细胞贴附的过程,影响细胞贴附的因素,细胞类型,(附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞上皮细胞血细胞(最弱),生物因素,血清、培养液中的促附着因子,机械，物理等其他因素,离心促进附着,流动培养液流动可阻止细胞附着,低温可抑制附着,促生长因子,现已证明，很多激素如胰岛素、氢化可的松等具有促进细胞生长作用。胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，用量为110U/ml。氢化可的松可促进表皮细胞和乳腺上皮细胞生长，并能提高胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率，用量为108 107mol/L。,人表皮生长因子（hEGF)对大鼠宫颈鳞状上皮细胞(RCEC)有促进增殖的作用。,表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等生长调节因子都能促进细胞的生长和增殖。,五、细胞培养污染及对策,培养细胞生长状况常规检查,培养液颜色与透明度的变化,细胞生长状况。,细胞形态变化。,微生物污染,培养液,PH,值,（颜色变化）,变黄，表示PH值下降，细胞生长旺盛，代谢产生的酸性物不断积累导致。,变红或紫红色，表示PH值上升，细胞生长停滞、死亡。,一般生长稳定的细胞需要23天换液1次，生长慢的细胞需要34天换液一次。,细胞换液,原代细胞经24小时培养，培养液颜色变浅，表示细胞代谢好。少量换液可刺激细胞生长。,通常每周两次，每次换半量或1/51/3量。原代细胞第1次换液时，切记不要把培养液全部倒掉。,细胞株（系）条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进行全量换液。这种情况下，最好减少细胞接种数，延长换液的时间。,细胞生长状况,常规应特别注意细胞的生长增殖情况。,原代细胞经历一个适应或潜伏期。,细胞系多为24小时以内。,细胞长满瓶底80%时应及时传代。,细胞形态变化,生长良好细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。,生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞之间空隙加大。,微生物污染,培养液颜色与透明度,培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。,支原体污染，没有明显症状，但细胞生长却明显变缓。,细胞培养污染的概念,不仅仅指微生物，包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物，因此一般包括微生物,(,真菌、细菌、病毒和支原体,),、化学物质,(,影响细胞生存、非细胞所需的化学成份,),及细胞,(,非同一种的其它细胞,),。其中以微生物污染最多见。另外随着细胞种类增多不同种细胞交叉污染也时有发生、从而造成细胞不纯。,污染的途径,空气空气是微生物传播的最主要途径。,净化工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可使净化工作不能正常进行,工作时不戴口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽等使外界气流过强,减少空气流动是防止污染的重要环节。,污染的途径,器材各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底,洗刷不干净，污物残留及培养用液等灭菌不彻底,CO2温箱由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，而CO2温箱内是开放式培养如不定期消毒,可形成污染.,污染的途径,操作,无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具或封瓶时不严,培养两种以上细胞时，操作不规范、交叉使用吸管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。,污染的途径,血清有些血清在生产时就已被支原体或病毒等污染，即可成为污染的来源。,组织样本原代培养的污染多数来源于组织样本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘可以影响细胞生长。,污染对细胞的影响,支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的,霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内压制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。,化学物质污染如重金属或其它化学试剂混入培养液中后，有的毒性较小、如能及时排出，细胞仍可存活但有些烃化物如多环芳烃等有致突变性，能导致细胞发生转化,细菌的污染和检测,细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌、白色葡萄球菌， 以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，,pH,改变。污染后细胞发生病理改 变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。,细菌污染,细菌污染的检测,肉眼直接观察法,培养检查法,显微镜观察法,PCR,检测,真菌污染,真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、 黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。,培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，肉眼可见；有的散在生长，倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列，培养液一般不发生浑浊。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡,真菌污染,支原体污染和检测,支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径,0.2um,，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。,培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。,扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体,支原体污染的检测,相差显微镜观察法,Hayflick,培养基直接培养法,DNA,荧光染色法（,Hoechst 33258,）,PCR,方法（即用型细胞培养中支原体检测,PCR,试剂盒）,病毒的污染和检测,细胞的直接观察,动物接种检查,电子显微镜观察,PCR,技术,污染的预防,防止污染，预防是关键，预防措施应贯穿于整个细胞培养的始终。,器皿准备,开始操作前,操作过程中,其他细节方面的预防,在培养液中加入适量的抗菌素。常规加入青霉素和链霉素各,100U/ml,。必要时加入庆大霉素、卡那霉素或两性霉素,B,等。,培养箱内应经常清洁消毒，放置含硫酸铜的消毒水。,购入的未灭活血清应采取,56,水浴灭活,30min,的措施以使血清中的补体和支原体灭活。,支原体污染的预防,小牛血清是造成支原体初级污染的主要来源,次级污染源，即已污染支原体的细胞在污染的传播中更为重要,保证培养细胞的来源绝对干净，同时应做好检测，一旦发现支原体污染就应废弃,严禁已知污染了支原体的细胞进入未污染的工作区域。,严格无菌操作，杜绝人为污染。,对每批小牛血清严格检查，灭活、过滤有利于抑制支原体的污染。,污染的清除,培养的细胞一旦污染应及时处理，防止污染其他细胞。,高压灭菌被污染的细胞，然后弃掉。,有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常,常用的排除微生物污染的方法有以下,4,种,抗生素排除法,抗生素是细胞培养中杀灭细菌的主要手段。,联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后应用好,有的抗生素对细菌仅有抑制作用，无杀灭效应。反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，而且对细胞本身也有一定影响,尽量不用抗生素处理,一些有价值的细胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在这种情况下，可采用,5,10,倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用,24,48,小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效,加温除菌,根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支原体污染的细胞置于,41,度作用,5,10,小时（最长可以达,18,小时）杀灭支原体,但是,41,度对细胞本身应有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。,动物体内接种,受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，从体内取出再进行培养繁殖。,与巨噬细胞共培养,在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活,7,10,天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的克隆生长。,巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。,利用,96,孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度地同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染的效能。,与抗生素联合应用效果更佳。,六、培养细胞生长的测定方法,细胞计数法,胎盘兰染色法,MTT比色法,细胞生长曲线法,3HTdR(3H胸腺嘧啶核苷）掺入法,BrdU (5bromo2deoxyuridine，5溴脱氧尿嘧啶核苷 ）掺入法,细胞计数法,细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度。,细胞计数结果以细胞数,/,毫升表示,细胞计数板,细胞计数板,细胞计数操作步骤,将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。,将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。,静置,3,分钟。,镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的,细胞计数操作步骤,按下式计算,（细胞悬液的细胞数）/ml （四个大格子细胞数/4)稀释倍数104 /ml,公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。,公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为,1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）0.1mm3,而 1ml1000mm3 。,细胞计数注意事项,要求悬液中细胞数目不低于,10,4,个,/ml,，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。,要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。,取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更应该每次取样都要混匀，以求计数准确。,细胞计数注意事项,数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。,如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。,操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。,台盼蓝染色法,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，活细胞所占总细胞中的百分比叫做细胞活力。,由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。,复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,细胞死亡后，细胞膜通透性改变，台盼蓝大量进入细胞内而不被排出呈蓝色。活细胞选择性强，不易着色,台盼蓝染色法,0.5ml,台盼蓝,0.3ml,培养液,0.2ml,细胞悬液,染色,5,15min,至少计数,500,个细胞中着色细胞数,细胞活力,=,（总细胞数着色细胞,)/,总细胞数,100,噻唑蓝 （,MTT,）比色法,原理活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶于水的蓝紫色产物颗粒（formazan)，并沉积在细胞中。二甲基亚砜（DMSO）或酸性异丙醇能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅（以OD值表示）与所含的formazan量成正比。可反映活细胞的代谢水平。而死细胞没有这种功能,MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等,噻唑蓝 （,MTT,）比色法,加入培养液量,10,的,MTT(5g/L),，继续,3,4h,培养,吸去培养液，加入等量异丙醇或,DMSO,，振荡,10min,490/630nm,测定,OD,值,细胞存活率实验组,OD,值,/,对照组,OD,值,100,细胞生长曲线法,观察同一代细胞的增殖过程，根据细胞生长曲线分析细胞的增殖速度，确定具体实验、细胞传代、细胞冻存的最佳时间,细胞生长曲线法,计数细胞浓度，等量加入培养板各孔，培养7天,以接种时间始， 每隔24h计数3孔细胞数目，取均值,以横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度（104 /ml),注1、各孔消化时间应一致。,2、计数细胞前应混匀。,3HTdR掺入法和BrdU掺入法,3HTdR掺入法是将用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到新合成的DNA中，通过测定3H放射性脉冲数比较不同细胞的增殖活性。,溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine ,BrdU）是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入S期细胞单链 DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。 BrdU被掺入到DNA复制位点，这些复制位点可用荧光剂或酶偶联的抗体检测。,七、细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞 冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经 费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。,如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生 大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞 器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形 成大冰晶，即冰晶的重结晶。,低温保护剂,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。,常用的低温保护剂是,DMSO,，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓 冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外 形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,预先配制冻存液含 10% DMSO、 20%血清培养基,取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)；,加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。,一般程序,冷冻过程要缓慢。4 3060 分钟20 30 分钟 80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存,冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。细胞浓度控制在11075107/ml。,冻存管置于程序降温盒中，超低温冰箱过夜，液氮罐中长期保存。,注意事项,细胞在冷冻过程中在20冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过20这一步骤直接放入80冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。,DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。,DMSO 必须是细胞培养级别的。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜。,细胞的复苏,在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。,操作要点,快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。,操作过程动作要轻 由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml 冻存细胞液加入到2530ml 新鲜完全培养液中），24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO,如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。,注意事项,解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入,37,水浴中。切不可直接用手，以免冻伤。,冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。,细胞库,American Type Culture Collection(ATCC),中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,中科院昆明细胞库,中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心）,