免疫组化-HE染色-FISH-ISH课件

6,版,第,儿科学,现阶段开展的病理实验,主要内容：,免疫组化,HE,染色,几种特殊的染色,原位杂交,荧光原位杂交,免疫组化,1,、免疫组化是利用,抗原,与,抗体,特异性结合的原理，通过,化学反应使标记抗体的显色剂,(,荧光素、酶、金属离子、同位素,),显色来确定组织细胞内抗原,(,多肽和蛋白质,),，对其进行,定位、定性及定量,的研究，称为免疫组织化学。,2,、我们现阶段主要要做的组织免疫组化有石蜡切片、冰冻切片免疫组化以及荧光免疫组化。细胞免疫组化有细胞爬片、细胞印片和细胞涂片免疫组化和荧光免疫组化。,3,、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中微波修复抗原对提高免疫组化阳性检出率非常有效。,4,、高压修复和微波修复法中常用的缓冲液有,0.01M,柠檬酸缓冲液、,1mM,的,EDTA,（,pH8.0,）。,6,、,酶标抗体系统中的酶与显色剂、复染液的合理选用：,（,1,）辣根过氧化物酶系统（,HRP,）显色剂一般用,DAB,、,AEC,DAB,显色液一般染色部位为棕黄色，,AEC,显色液一般染色部位为红色；而,HRP,系统常用的复染液为苏木素，将细胞核染成蓝色。,（,2,）碱性磷酸酶系统（,AP,）显色剂一般用,BCIP/NBT,、固红、固蓝。最常用的是,BCIP/NBT,显色液，染色部位为深蓝色或者蓝紫色；该系统常用的复染液为核固红，将细胞核染成红色。,免疫组化切片组织前期处理,1,、组织块大小应限于,2cm1.5cm0.2cm,。,2,、应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求,5m,左右，神经组织的研究要求切片厚度在,20-100m,，有利于追踪神经纤维的走行。,3,、石蜡切片为常规制片技术，切片厚度,2,7m,，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。,4,、组织的固定：,4%,多聚甲醛固定一般,1-2,小时。固定后经充分的流水冲洗后进行脱水包埋。,5,、组织脱水：,主要用,不同梯度的酒精,进行脱水。一般情况下，组织经过,70,，,80,，,90,，,95,，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次,95,酒精，两次,100,酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。,6,、组织透明：我们一般采用二甲苯透明，,30-60min,即可。,5,、,石蜡切片,：浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在,60,以下,，以熔点低的软蜡较好,浸蜡时间,1,4,小时。,6,、,冰冻切片,：组织采用,液氮法包埋,。将未固定的组织放入,OCT,包埋剂中对组织进行液氮包埋，包埋后放在,-80,度冰箱中贮存或者对其进行切片。或者将组织置于,20%-30%,蔗糖溶液中,1-3,天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量，再放入,OCT,包埋剂中进行包埋。,7,、切片的固定：冰冻切片、细胞切片常用固定液为,4,丙酮或者,4%,多聚甲醛，固定,10-30min,。,石蜡切片免疫组化,1,、石蜡切片脱蜡至水。,2,、,3%H,2,O,2,室温孵育,5-10min,，以消除内源性过氧化物酶的活性，水洗，,5min3,次。,3,、根据客户抗体要求进行修复，,PBS,冲洗，,2min3,次。,4,、,5-10%,正常山羊血清封闭（,5%BSA,封闭,20-30min,），室温孵育,20-30min,。倾去血清，勿洗。,5,、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（,PBS,配制），,37,孵育,1-2,小时或,4,过夜。（室温,20-30min,，再放于,37,孵育,20-30min,）,6,、,PBS,冲洗，,2min3,次。,7,、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，,37,孵育,10-30min,。,8,、,PBS,冲洗，,2min3,次。,9,、滴加即用型,SABC,，,37,孵育,10-30minPBS,冲洗，,5min4,次。,10,、显色剂显色（,DAB,或,AEC,）。,11,、自来水充分冲洗，复染（苏木素），脱水透明，封片。,返回,B,石蜡切片免疫组化,DAB,显色,血涂片，细胞，冰冻切片免疫组化,1,、冰冻切片,4-8m,，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于,-20,冰箱。,2,、室温放置,30min,后，放入,4,丙酮或者,4%,多聚甲醛固定,10-30min,。,PBS,冲洗,5min3,次。,3,、,30%,过氧化氢,1,份,+,纯甲醇,50,份混合，室温浸泡,30min,，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗,2,次。,4,、其余步骤和石蜡切片免疫组化,4-11,步相同。,注：如果冰冻切片直接染色结果不理想时，可以参照石蜡切片对切片进行热修复，方法和石蜡切片,3-11,步相同。,石蜡切片荧光免疫组化,1,、石蜡切片脱蜡至水。,2,、与石蜡切片免疫组化,3-8,的步骤相同。,3,、加入,SABC-FITC,37,孵育,10-30min,，,PBS,冲洗，,5min4,次。,4,、抗荧光萃灭封片液 封片，荧光显微镜观察。,冰冻切片荧光免疫组化,1,、冰冻切片,4-8m,，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于,-20,冰箱。,2,、室温放置,30min,后，放入,4,丙酮或者,4%,多聚甲醛固定,10-30min,。,PBS,冲洗,5min3,次。,3,、,5-10%,正常山羊血清封闭，室温孵育,10-30min,。倾去血清，勿洗。,4,、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，,37,孵育,1-2,小时或,4,过夜。,5,、,PBS,冲洗，,5min3,次。,6,、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，,37,孵育,10-30min,；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，,37,或室温孵育,10-20min,。,7,、,PBS,冲洗，,5min3,次。,8,、滴加,SABC-FITC,37,孵育,10-30min,，,PBS,冲洗,5min3,次。,9,、抗荧光萃灭封片液 封片，荧光显微镜观察。,细胞爬片免疫组化,1,、取出培养皿，用,PBS,漂洗,2min2,次,.,2,、,4,冷丙酮或,4%,的多聚甲醛固定的细胞爬片，室温,10-30,分钟。,PBS,漂洗,2min3,次。,0.5%TritonX-100,室温处理,20min,。,PBS,洗,2min3,次，,3%,过氧化氢室温处理,15min,，,PBS,洗,2min3,次。,3,、血清封闭：室温,10-30,分钟，倾去。,4,、一抗：,37 1,小时或,4,度过夜,5,、,0.1M PBS,洗三次,-,每次三分钟。,6,、相应的生物素化二抗,37 30-40,分钟。,7,、,0.1MPBS,洗三次,-,每次三分钟。,8,、链酶卵白素,-,碱磷酶复合物或过氧化物酶标记链酶卵白素,37 40min,。,9,、,NBT/BCIP,或,DAB,显色，核固红或苏木素复染。,10,、切片经梯度酒精脱水干燥，,(,二甲苯透明,),，中性树胶封片；,注意事项：,1,、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：,（,1,）对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达,5,天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片；,（,2,）接种的细胞密度适中，以,2*10,4,/ml,为宜，若细胞密度太高，,5,天后细胞连接成片冲洗时易脱片；,2,、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于,4,度冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用,80%,冰丙酮或,4%,多聚甲醛固定。,3,、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）,4,、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜,5,、,Triton X-100,（曲拉通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。,免疫组化中常用的固定液,1.,冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。,将纯的丙酮预先放入冰箱,-20,后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，,PBS,洗,2,遍，便可加入冷丙酮于,-20,（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定,10,分钟。取出后，室温吹干，然后放入,-20,保存。,2.,多聚甲醛,(,常用,4%),：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及,TUNEL,染色。,主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇,(CD),、主要组织相容性抗原等,室温固定,15,分钟后，将表面液体吹干，入,-20,保存,3.95,乙醇，可用于免疫组化。,优点：穿透性强、抗原性保存较好。,缺点：醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度,室温固定,15,分钟后，将表面液体吹干，入,-20,保存,4.,甲醛,(,福尔马林,),应用最广,优点：形态结构保存好，且穿透性强，,缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液,pH,降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。,返回,HE,染色,苏木精,伊红染色法,(hematoxylin-eosin staining,，,HE),是石蜡切片技术里常用的染色法之一。,HE,染色法是,组织学,、,胚胎学,、,病理学教学,与,科研,中最基本、使用最广泛的技术方法。,HE,染色的原理：脱氧核糖核酸（,DNA,）两条链上的,磷酸基,向外，带,负电荷,，呈,酸性,，很容易与带,正电荷,的苏木精,碱性染料,以,离子键结合,而被染色。伊红是一种化学合成的,酸性染料,，在水中离解成带,负电荷,的阴离子，与蛋白质的,氨基正电荷的阳离子,结合使,胞浆,染成红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。,石蜡切片,HE,染色步骤：,1,、脱蜡水合。,2,、蒸馏水洗,5min3,次。,3,、苏木素染液染色，镜下控制染色时间。,4,、水洗玻片上多余染液，,0.5-1%,盐酸酒精分色数秒。,5,、流水冲洗,15-30s,，细胞核呈蓝色。,6,、,0.5%,伊红染液染色,1-5min,。蒸馏水浸泡,5min,。,7,、风干，封片。,细胞爬片,HE,染色,1,、取出细胞爬片，用,PBS,洗涤,3,次。,2,、样品固定：,95,乙醇固定,20min,，,PBS,洗涤,2,次，每次,2min,。,3,、其余步骤和石蜡切片,3-7,步,相同。,冰冻切片,HE,染色,1,、固定：固定,1-2min,。,(,配制方法：,40%,福尔马林,15 mL,，,95%,乙醇,80 mL,，冰乙酸,5 mL),2,、其余步骤和石蜡切片,2-7,步,相同。,染色结果：,细胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其他部位呈深浅不同的红色。,返 回,常用特殊染色,一、弹力纤维染色,1,、弹性纤维主要由弹性蛋白（一种黄色硬蛋白，它是黄色弹性纤维组织的主要成分，干燥时易脆，而湿润时呈弯曲并富弹性）构成。新鲜时它呈黄色，固又称为黄色纤维。弹性纤维较细，直径,0.2-1.0um,，有分支，不成束。但可交织成网。它富有弹性，容易拉长，但不能拉到超过它的极限，外力除去后又恢复原状。,2,、弹性纤维染色的临床应用,1,）用于区别正常的动脉和静脉以及观察动脉有病变时血管壁各层的情况，如动脉粥样硬化时的各类变化。,2,）用于区别观察各种疾病对弹性纤维的影响及变化，如原发性或继发性高血压可见主动脉弹力纤维增生，老年弹力纤维增多症。心内膜弹力纤维增生症常都可见到弹力纤维断裂，梅毒性主动脉炎和皮肤的环状肉芽肿，动脉粥样硬化均可见到裂解，崩解的弹力纤维。,3,）用于弹力纤维性假黄瘤的诊断。该病镜下见真皮中下部结缔组织变性，呈团块状或条索状，弱嗜碱性用弹力纤维染色法可以鉴别。,3,、弹性纤维的染色方法：维格特氏雷锁辛品红法、,Gomoris,醛品红法、地衣红技术、费尔霍夫氏酒精