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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,实验二 血清,球蛋白的分离纯化与鉴定,层析技术,实验原理,实验思路,实验流程及操作注意事项,层 析 技 术,1,层析法,：又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,.,2.,依据,：混合物中各组分的理化性质差异,吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。,固定相,固定不动,流动相,对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。,3,基本原理,：固定相和流动相,4,分类,：,流动相的物理状态：气相和液相,气液,/,固，,液固,/,液,方式：纸、薄层、,柱,原理：吸附、分配、,凝胶,、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相,5,凝胶层析,(,凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析,),定义,：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。,基本原理：,固定相,：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、,交联葡聚糖,、聚丙烯酰胺、琼脂糖,-,葡聚糖复合凝胶。,流动相,：洗脱液,交联葡聚糖凝胶,多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗粒，商品名为,Sephadex,G,系列,G,交联度：,G,后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有,G-10,，,G-15,，,G-25,，,G-50,，,G-75,，,G-100,，,G-150,，和,G-200,八种，具体含义为凝胶得水值的,10,倍或吸水量（,g,）,/10g,干胶,交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，,“,G,”,反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。,长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接,凝胶层析的基本原理,样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动,小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出,大小分子彼此分开,l,分子大小不同混合物上柱；,2,洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；,3,大小分子分开：,4,大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中,数学模型,Vo Vi,Vt,Vi,凝胶孔内水（内水）,Vo,颗粒间水（外水）,Vg,凝胶体积,总体积,Vt,=,Vi,+,Vo,+,Vg,Kd,分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数,Ve,洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积,Ve,=,Vo,+,Kd,Vi,洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度,/,吸光度为纵坐标作图,（,1,）完全被排阻的极端大分子，,Ve,=,Vo,，,Kd,=0,（,2,）中等分子，,Ve,=,Vo,+,Kd,Vi,，,0,Kd,1,影响因素,*层析柱的选择及装填：,柱大小,分离样品量,凝胶型号,分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子,/,完全渗透分子。,*洗脱液：溶解待分离物质，不变性,*加样量：,1%,5%,*,凝胶的再生,凝胶型号,颗粒大小（,m,),溶胀体积,(ml/g),分离范围（,Mr,）,G-10,40,120,2,3,710,2,G-15,50,150,2.5,3.5,1.510,3,G-25,50,150,4,6,110,3,510,3,G-50,40,120,9,11,1.510,3,310,4,G-75,40,120,12,15,310,3,810,4,G-100,40,120,15,20,410,3,110,5,交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数,实验原理,透析及超滤法,盐析、有机溶剂,/,免疫沉淀,电泳,凝胶层析,离子交换层析,超离心,共性,：*生命高分子：透析、超滤、超离心、,凝胶层析,*蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷,盐析,/,有机溶剂沉淀*两性电解质和等电点：,pH,pI,，蛋白质带负电；反之带正电,电泳、离子交换层析*有一定的功能：抗原性,免疫沉淀,个性,：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同,分离依据：蛋白质理化性质的和个性,清蛋白,pI,=4.9 57%,72%,1,2%,5%,2,pI,6 4%,9%,6.5%,12%,pI,=7.3 2%,20%,球蛋白,实验思路,分段盐析去除杂蛋白,凝胶层析脱盐,交联葡聚糖吸水浓缩,醋酸纤维素薄膜电泳鉴定,上午完成,下午完成,先粗后细,分段盐析：,常用中性盐：,硫酸铵,、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。,硫酸铵,：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分段盐析效果好，不易引起变性。溶液,pH,约,4.5,5.5,，可用硫酸,/,氨水按需要调节,pH,值。,分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、,pI,不同，所需的盐浓度、,pH,也不一样。如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度及,pH,可使各种蛋白质分段沉淀。,实验流程及操作注意事项,影响因素：,温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需,4,度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在,25,度比,0,度时溶解度低，更易盐析。,pH,值：大多数蛋白质在,pI,时溶解度最低。,pH=,pI,效果更好。,蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在,2.5-3.0%,。,凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶,G-25/50,过柱，用时较短。固定相：,sephadex,G-25,流动相：,pH7.4,的,0.01M,磷酸盐缓冲液（,0.9%NaCl,）原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。,浓缩：,sephadex,G-25,吸水，利用高分子性质。,注意事项：,1,硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入,2,流洗柱子：,3,4,个柱长,3,上样：转圈滴加，起跑线一致,4,防止柱上液层干涸,5,洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，无纳氏试剂,6,G-25,干胶用纸条少量多次加入，液层高,PI PH=PI PHPI,电泳用于分离物质的原理：,蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向阳极移动的速度不同。经过一定的电泳时间后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。,醋酸纤维素薄膜电泳介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。,电泳缓冲液：,pH8.6,的巴比妥缓冲液,清蛋白,pI,=4.9 57%,72%,1,2%,5%,2,pI,6 4%,9%,6.5%,12%,pI,=7.3 2%,20%,球蛋白,清蛋白,1,2,清蛋白（,albumin,，,A,）：,38,48g/L,球蛋白（,globulin,，,G,）,：,15,30g/L,A/G,：,正常值,1.5,2.5,清蛋白,1,2,加样线,加样线,纯化蛋白,对照,样品,【,操作步骤,】1,点样,：取经巴比妥缓冲液浸透的,28cm,薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端,2cm,处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清,/,样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置,5,10,分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。,2,通电,：接通电源，调节电压为,40,50V,，通电,2,2.5h,，关闭电源，停止电泳。,3,染色,：薄膜浸入氨基黑,B,染色液,2,5,分钟。,4,漂洗,：取出薄膜在漂洗液中漂洗,4,5,次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。,5,）醋酸纤维素薄膜电泳在临床上的应用,实验二 血清,球蛋白的分离纯化与鉴定,实验二 血清,球蛋白的分离纯化与鉴定,
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