分子生物学研究技术(理论)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子,生,生物,学,学研,究,究技,术,术,朱国,辉,辉,ghzhu,一般,认,认为1973,年,年是,基,基因,工,工程,诞,诞生,的,的元,年,年。,上世,纪,纪40年,代,代,70年,代,代初,分,分子,生,生物,学,学领,域,域理论,上,上的,三,三大,发,发现和技术,上,上的,三,三大,发,发明对于,基,基因,工,工程,的,的诞,生,生起,到,到了,决,决定,性,性的,作,作,。,第一,节,节,基,基,因,因工,程,程的,诞,诞生,1944,年,年，AveryO.T.,利,利用,肺,肺炎,双,双球,菌,菌转,化,化实,验,验,1、DNA是,遗,遗传,物,物质,被,被证,实,实,理论,上,上的,三,三大,发,发现,40,年,年代,，,早在上世纪20年代，已经知道染色体由DNA和组蛋白构成，但组成蛋白的,氨基酸有20种,，而组成DNA的,核苷酸只有4种,，什么是遗传物质？,1928年，英国微生物学家F. Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。,（1）S型：注射小白鼠，死亡。,（2）S型，65 加热：注射小白鼠，活。,（3）R型：注射小白鼠，活。,（4） 65 加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。,40,年,年,代,代,，,，DNA,是,是,遗,遗,传,传,物,物,质,质,被,被,证,证,实,实,（1） S型菌无细胞提取物及其,纯化的DNA,都可使R型菌转变成S型菌；,（2）经,DNase,处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。,（3）经,胰蛋白酶,处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。,不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是,现代生物科学的革命性开端,。,Watson,和,和Crick,2,、,、DNA,双,双,螺,螺,旋,旋,模,模,型,型,的,的,提,提,出,出,50,年,年,代,代,，,，DNA,的,的,双,双,螺,螺,旋,旋,模,模,型,型,的,的,提,提,出,出,和DNA,复,复,制,制,机,机,理,理,的,的,阐,阐,明,明,DNA,是,是,遗,遗,传,传,物,物,质,质,已,已,被,被,证,证,实,实,，,，,但,但,是,是DNA,是,是,怎,怎,样,样,携,携,带,带,并,并,传,传,递,递,遗,遗,传,传,信,信,息,息,的,的,？,？,在,在,细,细,胞,胞,增,增,殖,殖,过,过,程,程,中,中,，,，DNA,是,是,怎,怎,样,样,复,复,制,制,的,的,？,？,因,因,此,此,，,，,对,对,于,于DNA,结,结,构,构,的,的,研,研,究,究,成,成,为,为,了,了,当,当,时,时,生,生,物,物,学,学,家,家,研,研,究,究,的,的,热,热,点,点,。,。,1953,年,年,，,，FrancisCrick,和,和JamesWatson,搜,搜,集,集,了,了,力,力,所,所,能,能,及,及,的,的,资,资,料,料,，,，,提,提,出,出,了,了DNA,的,的,双,双,螺,螺,旋,旋,模,模,型,型,。,。随,后,后,，,，DNA,的,的半,保,保,留,留,复,复,制,制和半,不,不,连,连,续,续复,制,制,机,机,理,理,也,也,被,被,阐,阐,明,明,，,，,为,为,基,基,因,因,工,工,程,程,的,的,诞,诞,生,生,奠,奠,定,定,了,了,坚,坚,实,实,的,的,理,理,论,论,基,基,础,础,。,。,Nireberg,等,等,为,为,代,代,表,表,的,的,一,批,批,科,科,学,学,家,家,3,、,、,“,“,中,中,心,心,法,法,则,则,”,”,的,的,提,提,60,年,年,代,代,，,，,确,确,定,定,了,了,遗,遗,传,传,信,信,息,息,的,的,传,传,递,递,方,方,式,式,（,（,中,中,心,心,法,法,则,则,）,）,既然，DNA,是,是遗传,信,信息的,载,载体，,那,那么它,是,是如何,传,传递遗,传,传信息,的,的呢？,遗,遗传信,息,息又是,如,如何控,制,制生物,的,的表型,性,性状的,呢,呢？,以Nireberg,等,等为代,表,表的一,批,批科学,家,家经过艰,苦,苦的努,力,力，确,定,定了遗,传,传信息,以,以密码,方,方式传,递,递，每,三,三个核,苷,苷酸组,成,成一个,密,密码子,，,，代表,一,一个氨,基,基酸，,到,到1966年,，,，全部,破,破译了64个,密,密码子,，,，并提出,了,了遗传,信,信息传,递,递的“,中,中心法,则,则”。,Smith等,分,分离并,纯,纯化了,限,限制性,核,核酸内,切,切酶,Hin,d II，1972年，Boy,er等,相,相继发,现,现了,co,R I,一,一类,重,重要的,限,限制性,内,内切酶,。,。,1、限,制,制性核,酸,酸内切,技术,上,上的,三,三大,发,发明,1967,年,年，,世,2、DNA连,接,接酶,的,的发,现,现和,应,应用,1972,年,年，,美,美国Stanford,大,大学,的,的P.Berg,等,等,首,3、,载,载体,的,的发,现,现及,其,其应,用,用,1973,年,年，Stanford,大,大学,的,的Cohen,等,等成,功,功地,利,利用,体,体外,重,重组,实,实现,了,了细,菌,菌间,性,性状,的,的转,移,移。,这一,年,年被,定,定为,基,基因,工,工程,诞,诞生,的,的元,年,年。,3、,载,载体,的,的发,现,现及,其,其应,用,用,Cohen等,的,的重,组,组实,验,验示,意,意图,Tc,r,Ne,r,Eco,RI,Eco,RI,连接酶,Tc,r,Ne,r,双抗重组菌落,基因,基因,工,工程,研,研究,的,的基,本,本步,骤,骤,1、,从,从生,物,物体,中,中分,离,离得,到,到目,的,的基,因,因（,或,或DNA,片,片段,）,）,2、,在,在体,外,外，,将,将目,的,的基,因,因插,入,入能,自,自我,复,复制,的,的载,体,体中,得,得到,重组DNA分,子,子。,3、,将,将重,组,组DNA,分,分子,导,导入,受,受体,细,细胞,中,中，,并,并进,行,行繁,殖,殖。,4、,选,选择,得,得到,含,含有,重,重组,DN,A分,子,子的,细,细胞,克,克隆,，,，并,进,进行,大,大量,繁殖,，,，从,而,而使,得,得目,的,的基,因,因得,到,到扩,增,增。,5、,进,进一,步,步对,获,获得,的,的目,的,的基,因,因进,行,行研,究,究和,利,利用,。,。比,如,如，,序列,分,分析,、,、表,达,达载,体,体构,建,建、,原,原核,表,表达,以,以及,转,转基,因,因研,究,究,和利,用,用等,。,。,基因,工,工程,的,的基,本,本流,程,程,基因,分,分离,酶,酶切,载体,酶,酶切,基因,和,和载,体,体连,接,接,导入,细,细菌,重组,质,质粒,繁,繁殖,重组,克,克隆,的,的选,择,择,序列,分,分析,和,和基,因,因表,达,达等,研,研究,导入植物细胞,第二,章,章,基,基,因,因操,作,作的,工,工具,酶,酶,第一,节,节,限,限,制,制性,核,核酸,内,内切,酶,酶及,其,其应,用,用,第二,节,节DNA,连,连接,酶,酶及,其,其应,用,用,第三,节,节DNA,聚,聚合,酶,酶及,其,其应,用,用,Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.,1、,限,限制,性,性核,酸,酸内,切,切酶,的,的分,类,类合,命,命名,2、II,型,型限,制,制性,核,核酸,内,内切,酶,酶的,基,基本,特,特性,3、,限,限制,性,性核,酸,酸内,切,切酶,的,的消,化,化反,应,应,第一,节,节,限,限,制,制性,核,核酸,内,内切,酶,酶,限制,性,性核,酸,酸内,切,切酶,的,的概,念,念,限制性核,酸,酸内切酶,（,（ Restriction endonucleases）,：,：是一类能,够,够识别双,链,链DNA,分,分子中某,种,种特定的,核,核苷酸序,列,列，并能,精,精确特异,地,地切割双,链,链DNA,分,分子的核,酸,酸内切酶,。,。已经从近300中,微,微生物中,分,分离出了500余,种,种限制性,核,核酸内切,酶,酶。,限制性核,酸,酸内切酶,的,的分类,1. 限,制,制修饰活,性,性,2. 内,切,切酶的蛋,白,白,质结构,3. 限,制,制辅助因,子,子,4. 切,割,割位点,5. 特,异,异性切割,6. 基,因,因克隆中,I 型,单一多功,能,能的酶,3种不同,亚,亚基,ATP、Mg,2+,和S-腺,苷,苷甲硫氨,酸,酸,距特异性,位,位点1000bp,不是,无用,II,型,型,限制酶和,修,修饰酶分,开,开,单一成分,Mg,2+,特异性位,点,点及其附,近,近,是,非常有用,III,型,型,双功能酶,2种亚基,ATP、Mg,2+,和S-腺,苷,苷甲硫氨,酸,酸,特异性位,点,点3端24-26bp处,是,有用,限制性核,1、寄主菌属,名,名的第一,个,个字母和,种,种名的头,两,两个字母,组,组成3个,斜,斜体,字母的略,语,语表示酶,来,来源的菌,种,种名称，,如,如大肠杆,菌,菌,Escherichia,coli,表示为,Eco, 流感,嗜,嗜血菌,Haemophilusinfluenzae,表示为,Hin,；,2、用一个正,体,体字母表,示,示菌株的,类,类型，比,如,如,Eco,R、,Hin,d；,3、如果一种,特,特殊的寄,主,主菌株具,有,有几个不,同,同的限制,修,修饰体系,，,，则,用罗马数,字,字标出，,比,比如,Eco,RI、,Hin,dIII。,II型限,制,制性核酸,内,内切酶的3大特点,1、识别,位,位点的特,异,异性每种酶都,有,有其特定,的,的DNA,识,识别,位点，通,常,常是由4,、,、5、6,或,或7个核,苷,苷酸组成,的,的特定序,列（靶序,列,列）。,2、识别,序,序列的对,称,称性靶序列通,常,常具有双,重,重旋转对,称,称,的结构，,即,即双链的,核,核苷酸顺,序,序呈回文,结,结构。,3、切割,位,位点的规,范,范性双链DNA被酶切,后,后，分布,在,在两,条链上的,切,切割位点,旋,旋转对称,（,（可形成,粘,粘性末端,或,或平,末端的DNA分子,）,）。,与II型,核,核酸内切,酶,酶有关的,几,几个概念,粘性末端,cohesiveends,因,酶,酶,切,切,位,位,点,点,在,在,两,两,条,条DNA,单,单,链,链,上,上,不,不,同,同,（,（,对,对,称,称,）,）,酶,酶,切,切,后,后,形,形,成,成,的,的,具,具,有,有,互,互,补,补,碱,碱,基,基,的,的,单,单,链,链,末,末,端,端,结,结,构,构,，,，,酶,酶,切,切,产,产,生,生,的,的,两,两,个,个,粘,粘,性,性,末,末,端,端,很,很容,易,易通,过,过,互,互,补,补,碱,碱,基,基,的,的,配,配,对,对,而,而,重,重,新,新连,接,接起,来,来,。,。,平,末,末,端,端Bluntend因,酶,酶,切,切,位,位,点,点,在,在,两,两,条,条DNA,单,单,链,链,上,上,相,相,同,同,，,，,酶,酶,切,切,后,后,形,形,成,成,的,的,平,平,齐,齐,的,的,末,末,端,端,结,结,构,构,，,，,这,这,种,种,末,末,端,端不,易,易重,新,新连,接,接起,来,来,。,。,几,种,种II,型,型,限,限,制,制,性,性,核,核,酸,酸,内,内,切,切,酶,酶,的,的,酶,酶,切,切,位,位,点,点,Pst,I,Provindencia stuartii,164,CTGCAG,GACGTC,Haemophilus influenzae,Rd,一,个,个,酶,酶,单,单,位,位（U,）,）指,：,：在,理,理,想,想,的,的,反,反,应,应,条,条,件,件,（,（,适,适,宜,宜,的,的,缓,缓,冲,冲,液,液,和,和,反,反,应,应,温,温,度,度,，,，,通,通,常,常,为,为37,）,）,下,下,，,，50,L,反,反,应,应,体,体,系,系,中,中,完,完,全,全,降,降,解,解1,g,DNA,所,所,需,需,要,要,的,的,酶,酶,量,量,。,。,影,响,响,酶,酶,活,活,性,性,的,的,因,因,素,素,很,很,多,多,，,，,最,最,重,重,要,要,的,的,有,有,：,：,A,.,DNA,的,的,纯,纯,度,度,和,和,甲,甲,基,基,化,化,程,程,度,度,B.甘,油,油,的,的,含,含,量,量,（,（,不,不,超,超,过,过5%,）,）,C.反,应,应,体,体,系,系,中,中,的,的,离,离,子,子,强,强,度,度,D.反,应,应,体,体,系,系,的,的pH,值,值,F.反,应,应,的,的,温,温,度,度,条,条,件,件,（,通,通,常,常,为,为,37,）,酶,单,单,位,位,的,的,定,定,义,义,和,和,影,影,响,响,酶,酶,活,活,性,性,的,的,因,因,素,素,Buffer(10,X,)2.0,L,Water16.5,L,DNA1.0,L,Enzyme0.5,L,Volume20.0,L,酶,切,切,反,反,应,应,的,的,基,基,本,本,步,步,骤,骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer (10,X,)2.0,L,Water16.5,L,DNA1.0,L,Enzyme0.5,L,Volume20.0,L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,1、DNA连接酶,作,作用的特,点,点,2、DNA连接酶,的,的反应条,件,件,第二节DNA,连,连接酶及,其,其应用,DNA连,接,接酶作用,的,的特点,A. 连,接,接的两条,链,链必须分,别,别具有3端自,由,由羟基（-OH）,和5 ,端,端磷酸基,团,团（-P,）,），而且,只,只有这两,个,个基团彼,此相邻时,才,才能进行,连,连接反应,；,；,B. 在,羟,羟基和磷,酸,酸基团间,形,形成磷酸,二,二酯键是,一,一种耗能,过,过,程，因此,连,连接反应,必,必须有能,量,量分子的,参,参与，通,常,常有,两种能量,分,分子，即ATP和NAD+,。,。,OK,NO,DNA连,接,接反应的,条,条件,连接反应,最,最佳温度,为,为37,，,，但是此,时,时粘性末,端,端间氢键,结,结合不够,稳,稳定，而,且,且酶活性,也,也会迅速,降,降低。比,如,如，EcoRI,粘,粘性末端,连,连接部位,只,只有4个,碱,碱基对，,很,很容易断,开,开。所以通常在4-16连接。,影响连接,效,效率的因,素,素有：,A. 温,度,度（最主,要,要的因素,）,）,B. ATP的浓,度,度,( 10,M -1M,),C. 连,接,接酶浓度,（,（平末端,较,较粘性末,端,端要求高,）,）,D. 反,应,应时间（,通,通常连接,过,过夜）,E. 插,入,入片段和,载,载体片段,的摩尔比,转化,4 过夜,加反应液,CK-,重组菌落,CK+,粘性末端DNA片,段,段的连接,Nick,Nick,1、大肠,杆,杆菌DNA聚合酶I,2、Klenow,片,片段,第三节DNA,聚,聚合酶及,其,其应用,大肠杆菌DNA聚,合,合酶I（,E。Coli,DNApolI）是KornbergA. 1956年,首,首先从大,肠,肠杆菌,E。Coli,细胞中分,离,离出来的,。,。它是一,种,种多功能,性,性的酶，,包,包括,3种不同,的,的酶活力,：,：,5-3聚合,酶,酶活性以双链DNA为模,板,板，催化,单,单核苷酸,结,结合到引,物,物的3,末,末端，并,不,不断延伸,。,。,5-3外切,酶,酶活性将双链DNA中游,离,离的5,末,末端逐个,切,切去。,3 -5外,切,切酶活性将游离的,双,双链或单,链,链DNA,的,的3端,降,降解。不,过,过对于双,链,链的降解,可,可被5-3的,多,多聚活性,所,所抑制。,CCG,GGCTATCGGA,CCG,GGCTATCGGA,Pol I + Mg,2+,A,T,A,G,CCT,CCGATAGCCT,GGCTATCGGA,CCGATAGCCT,GGCTA,CCGATAGCCT,GGCTATCGGA,Pol I + Mg,2+,CCGATAGCCT,GGCTA,Pol I + Mg,2+,T,1、大肠,杆,杆菌DNA聚合酶I,2、Klenow,片,片段,第三节DNA,聚,聚合酶及,其,其应用,Klenow片段,的,的主要用,途,途,Klenow片段大肠杆,菌,菌聚合,酶,酶 I,全,全酶,经,经枯草,杆,杆菌蛋,白,白酶处,理,理后产,生,生的大,片,片段酶,分,分子，,它,它仍然,有,有5,3,的,的聚合,酶,酶活性,和,和3, 5,的,核,核酸外,切,切酶活,性,性，但,失,失去了53的,外,外切酶,活,活性。,Klenow,片,片段的,主,主要用,途,途,修补限,制,制性酶,消,消化DNA形,成,成的3,隐蔽,末,末端,标记DNA片,段,段的末,端,端,cDNA克,隆,隆中第二链cDNA的,合,合成,DNA序列,的,的测定,GAA,CTTAA,第三章,基,基因克隆的,载,载体,引,言,言（introduction）,第一节,质,质粒载体,（,（plasimidvectors）,第二节,噬,噬菌体载,体,体（phage vectors,）,）,第三节,柯,柯斯质粒,载,载体（cosmidvectors）,第四节,人,人工染色,体,体载体（B/Y/HAC）,引 言,基因克隆的,本,本质是使目的基,因,因在特定的,条,条件下得到扩增和表达，而目的基,因,因本身无法,进,进行复制，,所,所以就必须,借,借助于“载体”及其“寄主细胞,”,”来实现。,作为基因克,隆,隆的载体必,须,须具备以下,特,特性：,能在寄主细,胞,胞中进行独,立,立的复制和,表,表达；,具有1-2,个,个选择标记,基,基因，如对,抗,抗生素的抗,性,性基因等；,具备多克隆,位,位点（MCS），而且,可,可携带外源DNA片段,的,的长度范围,较,较宽。,自身分子量,较,较小，在寄,主,主细胞中的,拷,拷贝数高，,易,易于操作和DNA的制,备,备。,Characteristicsof vectors forgenecloning,MCS,Marker,Foreign gene,第三章,基,基因克隆的,载,载体,引,言,言（introduction）,第一节,质,质粒载体,（,（plasimidvectors）,第二节,噬,噬菌体载,体,体（phage vectors,）,）,第三节,柯,柯斯质粒,载,载体（cosmidvectors）,第四节,人,人工染色,体,体载体（B/Y/HAC）,第一节,质,质粒载体,（plasimidvectors）,1、质粒载,体,体的生物学,特,特性,2、质粒载,体,体相关知识,介,介绍,1.质粒载,体,体的生物学,特,特性,（1）质粒,是,一种广泛从,在,在于细菌细,胞,胞中染色体以,外的能自主的复制,的裸露的环状双链DNA分子，比病,毒,毒更简单。,在,在霉菌、蓝,藻,藻、酵母和,一,一些动植物,细,细胞中也发,现,现了质粒，,目,目前对细菌,的,的质粒研究,得,得比较深入,，,，特别是大,肠,肠杆菌的质,粒,粒。,1.质粒载,体,体的生物学,特,特性,（2）,质粒的大小,差异很大，最小的只,有,有1kb,只,只能,编码中等大,小,小的2-3,种,种蛋白质分,子,子，最大的,达,达到,200kb,。,。,（3）,质粒的生存,在寄主细胞,中,中“友好”地“借居”，离开了寄,主,主它本身无,法,法复制，它,可,可以赋予,寄,寄主,一,一些非染色,体,体控制的遗,传,传性状，以,利,利于寄,主的生存。,比,比如，对抗,菌,菌素的抗性,，,，对重金属,的抗性等。,1.质粒载,体,体的生物学,特,特性,（4）质粒的复制,类,类型,一种质粒在,宿,宿主细胞中,存,存在的数目,称,称为该质粒,的,的拷贝数。据拷贝数,将,将质粒分为,两,两种复制型,：,：“严紧型”,质,质粒（stigent plasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxedplasmid）,拷贝数为10-60。不过，即,使,使是同一质,粒,粒，其拷贝,数,数在不同的,寄,寄主细胞间,也,也可能有很,大,大的变化。,（5）,质粒的不亲,和,和性,两种亲缘关,系,系密切的不,同,同质粒不能,在,在同一宿主,细,细胞中稳定,共,共存。,1.质粒载,体,体的生物学,特,特性,（6）,质粒的存在,形,形式,有超螺旋、,开,开环双螺旋,和,和线状双螺,旋,旋三种，,双螺旋共价闭合环（超螺旋）,开环双螺旋（一个裂口）,线状双螺旋（两个裂口）,第一节,质,质粒载体,（plasimidvectors）,1、质粒载,体,体的生物学,特,特性,2、质粒载,体,体相关知识,介,介绍,质粒：,是一种裸露,的,的双链闭环DNA分子,，,，它们在寄,主,主细胞中能,够,够独立地自,我,我复制从而,得,得到不断的,繁,繁殖。作为,基,基因工程载,体,体，质粒至,少,少应该具备复制的起始,区,区、选择标,记,记基因区、,多,多克隆位点等部分。,多克隆位点,：,克隆载体中,的,的一段用于,插,插入外源DNA片段的,特,特定区域，,由,由一系列的,紧,紧密相连的,限,限制性内切,酶,酶位点组成,，,，而且每个,限,限制性内切,酶,酶位点应该,在,在整个载体,中,中是唯一的,。,。,选择标记,基,基因：,在基因工,程,程中的一,类,类用于选,择,择转化细,胞,胞（菌）,的,的抗性基,因,因，通常,是,是一些抗,生,生素抗性,基,基因，比,如,如对氨苄,青,青霉素、,四,四环素、,氯,氯霉素、,卡,卡那霉素,以,以及潮霉,素,素等具有,抗,抗性的基,因,因。这样,，,，通过在,培,培养基中,加,加入特定,的,的抗生素,就,就可以选,自,自得到转,化,化的细胞,（,（菌）。,（1）,-互补,(,alpha,-complementation),大,肠,肠,杆,杆,菌,菌,-,半,半,乳,乳,糖,糖,苷,苷,酶,酶,可,以,以,和,和,其,其,底,底,物,物X-Gal相,互,互,作,作,用,用,并,并,且,且,释,释,放,放,出,出,一,一,种,种,蓝,蓝,色,色,物,物,质,质,，,，,当,当,该,该,酶,酶,的,的,-,片,片,段,段和-,片,片,段,段分,开,开,时,时,就,就,失,失,去,去,了,了,这,这,种,种,显,显,色,色,的,的,功,功,能,能,。,。,通,通,常,常,将,将,编,编,码,码,该,该,酶,酶-,片,片,段,段的,Lac,Z基,因,因,插,插,入,入,到,到,载,载,体,体,的,的,多,多,克,克,隆,隆,位,位,点,点,的,的,侧,侧,翼,翼,序,序,列,列,中,中,，,，,而,而,在,在,一,一,些,些,人,人,工,工,构,构,建,建,的,的,大,大,肠,肠,杆,杆,菌,菌,株,株,系,系,中,中,却,却,只,只,能,能,编,编,码,码,产,产,生,生,该,该,酶,酶,的,的,片,片,段,段,。,这,这,样,样,一,一,来,来,，,，,含,含,有,有,功,功,能,能,性,性,完,完,整,整,的,的,Lac,Z基,因,因,的,的,载,载,体,体,导,导,入,入,到,到,这,这,类,类,寄,寄,主,主,细,细,胞,胞,中,中,时,时,，,，,载,载,体,体,编,编,码,码,的,的,-,片,片段,就能,和,和寄,主,主编,码,码的,片,段,段,发生,互,互补,并,并具,有,有了,对,对底,物,物X-gal,的,的作,用,用功,能,能（,发,发生,显,显色,反,反应,）,），,这,这种,现,现象,被,被成,为,为是,alpha,-complementation.,2.,质,质,粒,粒载,体,体相,关,关知,识,识介,绍,绍,所以,含,含有,这,这类,载,载体,的,的菌,落,落就,很,很容,易,易在,含,含有,底,底物X-Gal和诱,导,导物IPTG的平,板,板上,分,分辨,出,出来,。,。因,为,为这,类,类菌,落,落中,释放,出,出的蓝色,物,物质,可,可以,将,将整,个,个菌,落,落染,成,成蓝,色,色，,非,非常,容,容易,辨,辨别,。,。,2.,质,质,粒,粒载,体,体相,关,关知,识,识介,绍,绍,（2,）,）PBR322,Thisisoneoftheearliestgeneralpurposecloningvectorstobedeveloped.Itisa4363bpplasmidwithtwoantibioticresistancegenes,for,ampicillin,and,tetracycline,.Thereareseveraluniquerestrictionsites.pBR322generallydoesnotgivesuchahighyieldofplasmidDNAasmodernvectorssuchaspUC,pGEMandpBluescript,2.,质,质,粒,粒载,体,体相,关,关知,识,识介,绍,绍,pBR322,4363,连接,加反应液,Tet,or,Amp,Tet,+,Amp,CK+,2.,质,质,粒,粒载,体,体相,关,关知,识,识介,绍,绍,思考,题,题,什么,是,是限,制,制性,核,核酸,内,内切,酶,酶，,它,它们,是,是怎,样,样命,名,名的,？,？,II,型,型限,制,制性,核,核酸,内,内切,酶,酶的,基,基本,特,特性,有,有哪,些,些？,什么,是,是粘,性,性末,端,端、,平,平末,端,端？,酶的单,位,位是怎,样,样定义,的,的，影,响,响酶活,性,性的因,素,素有哪,些,些？,DNA,连,连接酶,的,的作用,特,特点有,哪,哪些？,大肠杆,菌,菌DNA聚合,酶,酶I,有,有哪些,不,不同的,酶,酶活力,特,特性，,各,各有何,利,利用价,值,值。,Klenow,片,片段和,大,大肠杆,菌,菌DNA聚合,酶,酶I有,何,何异同,？,？,基因克,隆,隆的载,体,体必须,具,具备哪,些,些特性,？,？,质粒载体的,生,生物学特性,有,有哪些？,第四章PCR技,术,术,PCR技,术,术简史,PCR的,原,原理,PCR的,反,反应体系,和,和方法,1989,年,年美国Science,杂,杂志列PCR 为,十,十余项重,大,大科学发,明,明之首,比,比喻1989年为PCR爆,炸,炸年,Mullis荣获1993年,度,度诺贝尔,化,化学奖。,PCR技,术,术简史,DNA的,复,复制,核酸体外,扩,扩增的设,想,想,聚合酶链,反,反应的发,明,明,1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,PCR技,术,术简史,DNA的,复,复制,核酸体外,扩,扩增的设,想,想,聚合酶链,反,反应的发,明,明,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）,基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制,最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪,1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR的,基,基本原理,PCR反,应,应条件,PCR过,程,程,PCR的,特,特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以,上,上,DNA双,螺,螺旋,DNA单,链,链,与引物复,性,性,DNA变,性,性,形成2条,单,单链,子链延伸,DNA加,倍,倍,PCR的,基,基本原理,PCR反,应,应条件,PCR过,程,程,PCR的,特,特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,子链延伸,DNA加倍,DNA变性,形成2条单链,模板DNA,95,PCR的,基,基本原理,PCR反,应,应条件,PCR过,程,程,PCR的,特,特点,50,引物1,引物2,DNA引物,PCR的,基,基本原理,PCR反,应,应条件,PCR过,程,程,PCR的,特,特点,引物1,引物2,DNA引物,72,Taq酶,Taq酶,PCR的,基,基本原理,PCR反,应,应条件,PCR过,程,程,PCR的,特,特点,第1轮结,束,束,第2轮开,始,始,PCR的,基,基本原理,PCR反,应,应条件,PCR过,程,程,PCR的,特,特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的,基,基本原理,PCR反,应,应条件,PCR过,程,程,PCR的,特,特点,72,第2轮结,束,束,PCR的,反,反应体系,PCR反,应,应条件,PCR过,程,程,PCR的,特,特点,标准的PCR反应体系,4种dNTP混合物 各200umol/L,引物 各10100pmol,模板DNA 0,.,12ug,Taq DNA聚合酶 2,.,5u,Mg,2+,1,.,5mmol/L,PCR的,基,基本原理,PCR反,应,应条件,PCR过,程,程,PCR的,特,特点,灵敏度高,皮克(pg=10,-12,)量级扩增到微克(ug=10,-6,)水平,能从100万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测的灵敏度可达3个RFU,细菌检测的最小检出率为3个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，24 小时完成扩增,扩增产物一般用电泳分析,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA,PCR的,应,应用,研究,基因克隆,，,，DNA,测,测序，分,析,析突变,诊断,细菌、病,毒,毒、寄生,虫,虫检测，,诊,诊断,人类基因,组,组工程,遗传图谱,的,的构建，DNA测,序,序，表达,图,图谱,法医,犯罪现场,标,标本分析,肿瘤,各种肿瘤,检,检测,其他,