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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,LC/MS/MS,在生物样品分析时的关键问题,吉林大学药物代谢研究中心,顾景凯,吉林大学药物代谢研究中心,简介,LC/ESI-MS/MS,是近,10,年来发展成熟的分析技术，它集高效液相色谱的高分离性能与质谱的高灵敏度、高选择性的优点于一体，已成为定量测定生物样品中药物及其代谢产物的最强有力分析手段。,然而，它在分析生物样品过程中也碰到了具有挑战性的问题,基质效应，对于以人参皂苷为代表的中性、热不稳定、难于离子化的皂苷类化合物来说，基质效应的影响更为严重。,离子抑制效应不仅影响检测的灵敏度，也影响定量的准确性，因为这种抑制效应在不同个体的相同生物基质间、甚至同一个生物样品在不同的色谱保留时间可能均不一样，这样就会使测试结果的准确性受到严重影响。,吉林大学药物代谢研究中心,基线,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,Time, min,20%,40%,60%,80%,100%,Intensity, cps,吉林大学药物代谢研究中心,血浆样品经液液萃取处理得到的谱图,Intensity, cps,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,Time, min,20%,40%,60%,80%,100%,吉林大学药物代谢研究中心,Intensity, cps,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,Time, min,20%,40%,60%,80%,100%,血浆样品经,SPE,处理得到的谱图,吉林大学药物代谢研究中心,尿样经液液萃取处理得到的谱图,Intensity, cps,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,Time, min,20%,40%,60%,80%,100%,吉林大学药物代谢研究中心,Intensity, cps,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,Time, min,20%,40%,60%,80%,100%,尿样经,2,次水洗后的液液萃取处理得到的谱图,吉林大学药物代谢研究中心,吉林大学药物代谢研究中心,考察基质效应方法,柱后补偿技术（,Post-column addition/infusion, PCA/PCI）,补偿标准品溶液，以空白基质提取物进样测定-位置、强度,标准溶液进样；等量的标准溶液加入空白基质提取物中进样；二者峰面积比较,液相系统,色谱柱,质谱,三通阀,注射泵,基质效应产生原因,外源杂质的引入（不同厂家生产的试管、肝素锂）,生物样品内源性基质共洗脱作用,co-elution,生物样品与分析物形成新的化合物,柱超载作用,(column overload),吉林大学药物代谢研究中心,吉林大学药物代谢研究中心,影响检测的灵敏度,1,影响定量的准确性,2,基质效应的结果,Key Point 2,选择合适的内标,提高待测物的,离子化效率、,降低基质效应,Key Point 1,关键问题,提高,LC/MS/MS,的工作效率,Key Point 3,吉林大学药物代谢研究中心,提高离子化效率,1,、改进雾化效果,产生更多更小的液滴，提高离子,/,分子转化比。,2,、模式选择及优化措施,酸性化合物流动相中加盐,如甲酸铵、乙酸铵，或碱（氨水）来增强化合物的离子化，一般采用负离子检测模式。,碱性化合物流动相中加酸以增强化合物的离子化,加甲酸的效果可能要好于醋酸和三氟乙酸。酸根负离子会与样品正离子结合降低离子化效率，且三氟乙酸会明显的抑制质谱信号响应，一般用正离子方式检测。,3,、慎重选择添加剂,商品化的,LC-MS,级醋酸铵、甲酸铵含有表面活性剂，抑制电离。实验中若需要，可以用氨水加酸调节而成。,吉林大学药物代谢研究中心,4,、优化仪器参数（,DP,、,CE,、,IS,等）,5,、盐类对离子信号的影响,一般小分子盐的摩尔浓度比较高时，在电喷雾系统中有强烈的竞争性离子化作用，导致较强的离子抑制效应，使得待测物的灵敏度明显降低。,其次，盐类的存在将产生一系列的离子加合峰，使得谱图的解析变复杂。此外，太多的盐类会腐蚀和污染质谱系统硬件，严重时导致硬件损坏，需要及时清洗。,高浓度的盐对电喷雾有明显负作用，微量盐可能有助于某些物质的灵敏度提高。一些不挥发盐，如磷酸盐、氯化钠等，对质谱造成不可逆损伤。高盐类样品，进样前一般要进行脱盐处理。,6,、控制进样浓度及上样量,色谱柱、质谱超载,吉林大学药物代谢研究中心,进样浓度大,上样量大,吉林大学药物代谢研究中心,Mass Spectrometry Reviews, 2001, 20, 362 387,消除/减小基质的途径,吉林大学药物代谢研究中心,样品处理,液相条件选择,质谱条件选择,Protein-precipitation,Liquid-liquid partitioning(extraction),Solid Phase extraction,Off-line/On-line 2-Dimension LC(column back-flushing),吉林大学药物代谢研究中心,样品前处理方法,选择合适的样品前处理方法是消除基质效应影响最有效的的方式，对于不同的样品处理方法，基质对每种组分的影响也不同，要通过实验综合其他参数（提取回收率，提取稳定性，定量限等）来确定样品前处理方法。,柱子的选择,填料的性质、大小、柱长、柱子口径,流动相的选择,组成、比例、流速、缓冲盐、信号增强剂、,pH,值；,洗脱方式的选择（等梯度、梯度）；,柱后补偿,碱性药物丙酸、异丙醇；酸性药物2-（2-,methoxyethoxy)ethanol,。,吉林大学药物代谢研究中心,优化液相色谱条件,适当地增加待测组分的保留时间；减少进样体积,离子源（,ESI、APCI）,选择：总的趋势,ESI,较,APCI,更易受基质效应的影响。,检测方式（负离子、正离子扫描方式）,吉林大学药物代谢研究中心,优化质谱检测条件,吉林大学药物代谢研究中心,双内标法提高,LC/MS/MS,分析的准确性,吉林大学药物代谢研究中心,提高,LC/MS/MS,的工作效率,Standard program,New program,吉林大学药物代谢研究中心,吉林大学药物代谢研究中心,谢,谢,
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