限制性内切酶原理

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,限制性核酸内切酶,演讲者：王凯,限制酶,II,型限制酶,限制酶的定义,1,限制性核酸内切酶,是可以识别,DNA,的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶，简称,限制酶,。限制酶在基因工程中广为使用。,限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，,破坏入侵的外源,DNA,，从而保护自身。,30,多年前，当人们在对,噬菌体,的,宿主特异性,的限制,-,修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种,“,限制,”,病毒生存的办法则可归功于细胞内部可,摧毁外源,DNA,的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于,大肠杆菌,的,EcoR I,和,EcoR II,，以及来源于,流感嗜血杆菌（,Haemophilus influenzae,）的,Hind II,和,Hind III,。这些酶可在特定位点切开,DNA,，产生可体外连接的基因片段。,限制酶的发现,命名,EcoR I,Escherichia,属名,Coli,种名,Ry13,株系,编号,切割频率,切割频率是指某限制性核酸内切酶在,DNA,分子中,预期的切割概率,。可以估算该限制性核酸内切酶在某种,DNA,分子中的,切点数,。,前提是：,假定,DNA,的碱基组成是均一的、碱基排列在,DNA,分子上是随机分布的,。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为,1/4,。,如果某限制性核酸内切酶的识别序列是,6 bp,，则其切割频率为,(1/4),6,=1/4096,，即每隔,4.1kb,就可能有一个切割点。当识别序列为,n,个,bp,，则其切割频率为（,1/4,）,n,。,限制酶的种类,2,I,型限制酶,通常其切割位点与识别位点相距千个碱基,不能准确定位切割位点。例如：,Eco,B,、,Eco,K,。,II,型限制酶,所识别的序列多为短的,回文序列,，切割位点与识别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：,Eco,RI,、,Hind,III,。,III,型限制酶,切割位点与识别位点相距,24-26,个碱基，不能准确定位切割位点。例如：,Eco,PI,、,Hinf,III,。,什么是回文序列？,GAATTAAG,C TTAATTC,GAATATTC,CTTATAAG,II,型限制酶,ApaI,识别序列：,5GGGCCC 3,BamHI,识别序列：,5 GGATCC 3,BglII,识别序列：,5 AGATCT 3,EcoRI,识别序列：,5 GAATTC 3,HindIII,识别序列：,5 AAGCTT 3,KpnI,识别序列：,5 GGTACC 3,NcoI,识别序列：,5 CCATGG 3,NdeI,识别序列：,5 CATATG 3,NheI,识别序列：,5 GCTAGC 3,NotI,识别序列：,5 GCGGCCGC 3,SacI,识别序列：,5 GAGCTC 3,SalI,识别序列：,5 GTCGAC 3,SphI,识别序列：,5 GCATGC 3,XbaI,识别序列：,5 TCTAGA 3,XhoI,识别序列：,5 CTCGAG 3,II,型限制酶切割,DNA,后形成,粘性末端,或,平末端,分别由,错位切和平切,形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。,粘性末端和平末端,5,NNN,GTTAAC,NNN,3,3,NNN,CAATTG,NNN,5,5,NNN,GTT AAC,NNN,3,3,NNN,CAA,TTG,NNN,5,5,NNN,GCGGCCGC,NNN3,3,NNN,CGCCGGCG,NNN 5,5,NNN,GC GGCCGC,NNN3,3,NNN,CGCCGG CG,NNN5,Hae,的识别序列,Not,的识别序列,5,粘性末端和,3,粘性末端,5,NN,GCGGCCGC,NN3,3,NN,CGCCGGCG,NN 5,5,NNN,GC-,OH,P-,GGCCGC,NNN3,3,NNN,CGCCGG-,P,HO,-CG,NNN5,5,粘性末端,3,粘性末端,5,NN,GGTACC,NN3,3,NN,CCATGG,NN 5,5,NN,GGTAC-OH P-C,NN3,3,NN,C-P HO-CATGG,NN 5,同尾酶,切割,不同,的,DNA,片段但产生,相同,的粘性末端的一类限制性内切酶。,5-G,GATC,C-3,3-C,CTAG,G-5,Bam,H I,Bcl,I,5-T,GATC,A-3,3-A,CTAG,T-5,5-A,GATC,T-3,3-T,CTAG,A-5,Bgl,5-U,GATC,Y-3,3-Y,CTAG,U-5,Xho,同裂酶,有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。识别序列和切割位点都相同的叫,同序同切酶,，识别序列相同但切割位点不同的叫,同序异切酶,。,例如：,Hpa,和,MspI,为同序同裂酶（,C,CGG,）。,Xma,I,和,Sma,I,为同序异裂酶，,都识别,CCCGGG,，但,Xma,I,的切点在,C,CCGGG,，形成带有,CCGG,的粘性末端；而,Sma,I,的切点则在,CCC,GGG,，形成平末端。,有些限制酶识别的序列,不是回文序列,。,Acc,的识别切割位点分别是,GTAGAC,和,GTCTAC,BbvC,的识别切割位点分别为,CCTCAGC,和,GGAGTCG,特殊的,II,型限制酶,GTATCGAC,CATAGCTG,CCTCAGC,GGAGTCG,1),DNA的纯度,2),DNA的甲基化程度,3),酶切消化反应的温度,4),DNA的分子结构,5),限制性核酸内切酶的缓冲液,6),Star,活性（星活性）,影响限制性酶活性的因素,限制酶消化,DNA,底物的反应效率，很大程度上取决于所使用的,DNA,的,纯度,。,DNA,制剂中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、,EDTA,、,SDS,以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制酶的活性。,提高限制酶对,低纯度,DNA,的反应效率，一般采用三种方法：,增加限制酶的用量。,扩大酶催化反应的体积。,（以使潜在的抑制因素被相应地稀释）,延长酶催化反应的保温时间。,DNA的纯度,DNA的甲基化程度,识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会严重影响酶的催化效率。,为避免这样的问题，在基因克隆中使用的质粒,DNA,是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株中提取的。,酶切消化反应的温度,不同的限制酶具有不同的最适反应温度。大多数核酸内切限制酶的标准,反应温度是,37,，有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的,37,，,SmaI,是,25,、,ApaI,是,30,；有些高于标准的,37,，例如,MaeI,是,45,、,BclI,是,50,、,MaelII,是,55,。,DNA,的分子结构,DNA,分子的不同构型对限制酶的催化效率也有很大的影响。某些限制酶切割超螺旋的质粒,DNA,或病毒,DNA,所需要的酶量，要比消化线性,DNA,的高出许多倍，最高的可达,20,倍。,核酸内切限制酶的缓冲液,II,型限制酶的最适,pH,一般是,6-8,缓冲液中通常含有,Mg,2+,。,Star,活性（星活性）,限制酶在一些特定条件下使用时，识别位点的,特异性降低,，可以把不同于正常识别的序列切断，这个现象叫,Star,活性。,Star,活性出现的频率，根据酶、底物,DNA,、反应条件的不同而不同。,Star,活性主要受低粒子强度、高,pH,值以及过高的甘油浓度的影响。,消化,DNA,样品后，需要钝化内切酶的活性，终止反应。,方法：,1,）,65,温浴,5-10,分钟，使酶失活。,2,）加入,EDTA,除去酶分子的镁离子，是使酶失活。,3,）加,SDS,或者尿素使酶解聚沉淀。,4,）用等体积的酚抽提酶解产物，提取,DNA,。,限制性内切酶反应的终止,限制性内切酶的保存,限制酶于,-20,用,50,的甘油保存。,基因工程中常用的工具酶有,限制酶,、,DNA,聚合酶,、,DNA,连接酶,、,逆转录酶,、,碱性磷酸酶,、,末端,转移酶,、,甲基化酶,。,型限制酶在基因工程中的的应用,3,将目的基因导入受体细胞前，需要用,相同,的限制酶将目的基因和载体切成相同的粘性末端，再通过碱基互补配对的方式，在连接酶的作用下，目的基因和载体完成连接。最后将连接好的重组载体导入细胞。,NN,AAGCTT,NN NN,GGATCC,NNN ,NN,TTCG,AA,NN NN,CCTAGG,NNN ,HindIII,BamHI,NNNNNNNNNNN,A A GC TT,NN NNN,GGA T CC,NNNNNNNNNNNNNNNNNN,NNNNNNNNN,TTCG,AA,NN NN,CCTAGG,NNNNNNNNNNNN,HindIII,BamHI,双酶切法,NNNNNNNNNNN,A A GC TT,NN NNN,G GA T CC,NNNNNNNNNNNNNNNNNN,NNNNNNNNN,TTCG,A A,NN NN,CCTAG G,NNNNNN,AGCTT,NN NN,G,A,NN NN,CCTAG,NNNNNNNNNNN,A,A GC TT,NN NNN,G,GA T CC,NNNNNNNNNNNNNNNNNN,NNNNNNNNN,TTCG,A,A,NN,NN,CCTAG,G,NNNNNNNNNNNN,为什么通常要用两种限制酶？,可以有效防止载体自连造成空载体。,连接酶,可不可以用一种酶切割目的基因和载体,？,可以，此时切割后的,载体,需要加入,碱性磷酸酶处理。,碱性磷酸酶可以,去除,酶切后切口的,磷酸,，从而使粘性末端在加入连接酶后不能重新结合。,5,NNN,GCGGCCGC,NNN3,3,NNN,CGCCGGCG,NNN 5,5,NNN,GC-,OH,p-,GGCCGC,NNN3,3,NNN,CGCCGG-,p,HO,-CG,NNN5,5,NNN,GC-OH GGCCGC,NNN3,3,NNN,CGCCGG HO-CG,NNN5,碱性磷酸酯酶,单酶切法,NNNNNNNNNNN,A A GC TT,NN NNNG GA T CCNNNNNNNNNNNNNNNNNN,NNNNNNNNN,TTCG,A A,NN NNCCTAGGNNNNNN,p,AGCTT,NN NN,A-,OH,HO,-A,NN NN,TTCGA,p,NNNNNNNNNNN,A,A GC TT,NN NNN,A,AG C TT,NNNNNNNNNNNNNNNNNN,NNNNNNNNN,TTCG,A,A,NN,NN,TTCGA,A,NNNNNNNNNNNN,DNA,连接酶,基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目的基因两侧的碱基并,没有,合适的酶切位点。怎么办？,Hsp70A,：,Ex-F,5 CGC,CA,T,ATG,CCAGCTATCGGAATCGATTTGG 3,Nde,I,Hsp70A,：,Ex-R,5,GC,GGCCGC,ATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3,Not,I,通常是设计合适的,PCR,引物,，让目的基因在,PCR,扩增后，两侧含有酶切位点,。,DNA,甲基化酶,4,甲基化酶：可以从活性甲基化合物,(,如,S-,腺苷甲硫氨酸,),上将其甲基转移到其他化合物的酶。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物