发光的大肠杆菌

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,17/3/30,0,发光的大肠杆菌,朱静宇 张明 石卉,制备感受态细胞,质粒扩增,质粒酶切,目的基因序列扩增,连接,转化,实验方案概述,材料,大肠杆菌,少量PET 28质粒（既为原核质粒又为真核质粒）,显示绿色荧光的PEGFP-N3质粒（为真核质粒）,制备大肠杆菌感受态细胞,挑取,E.coil,单菌落接种至,2mlSOC,培养液，,37,摇床过夜。,挑取,0.51ml,过夜培养的菌液转种,到,50ml SOB,中，,18,剧烈震荡，直至,A,600,达到,0.6,，取出水浴,10min,4,4000rpm/min 10min.,同时冰浴配置,TB,溶液。,弃上清，倒置离心管于滤纸上,1mlTB,溶液打散菌体沉淀，,再加入,15mlTB,溶液冰浴,10-15min,。,4,4000rpm/min 10min,去上清，沉淀重悬于,4mlTB,中，冰浴,10min,加入,280uL DMSO,混合均匀，冰浴,10min,分装于,EP,管中，,-80,或液氮保存,检测感受态细胞,的质量（阴性对照）,质粒扩增,pet28,的质粒扩增,PEGFP-N3,质粒扩增,摇菌,转化,提质粒,转化,取,100ul,感受态细胞于冰浴上融化,加入,1ul,pet28,质粒和,1ul PEGFP-N3,质粒，轻轻吹匀，冰浴,30min,将菌液放入,42C,水浴热激90s，立即放入冰浴中2min,将菌液2000rmp/min离心3min，留200ul上清液将菌体打散，均匀涂布于含,卡那,抗性的琼脂平板，平板于37C倒置培养过夜,。,同时进行阳性和阴性对照,摇菌+提质粒,将培养过夜的平板取出，用已灭菌的枪尖挑取平板上单个的较大的菌落,将移液枪尖打入,5,ml,培养基内，放入,37C,摇床中,rpm/min,摇菌,16,小时左右,运用,Omega,等品牌的试剂盒对菌液进行小提,用浓度为,1%,的胶，,120V,20min,，用,1,0000,的,marker,做对照验证,测浓度,质粒的酶切,寻找,pet28,和,pegfp-,n3,的酶切位点,质,粒的酶,切（两个质粒同时酶切）,确定的酶切位点：,EcorR,I,、,Xba I,内切酶,：,Not,I,、,B,amH,I,内切酶,Buffer,：,cutsmart,37,温育,4,hours,未酶切的质粒作对照,，,1%,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果,纯化,01,02,03,04,05,06,设计引物,PEGFP-N3,目的基因扩增,PCR,电泳,胶回收,纯化,测序,PEGFP-,N3,目的基因,EGF,的,PCR,引物,PEGFPN5,5TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG3,PEGFPN3,5GTCGCCGTCCAGCTCGACCA3,Primer 2,Tm 68.5 C,Molecular weight 6863.5 g/mol,Extinction coeficient 181100.0 l/(molcm),Primer#1,Tm 57.6 C,Molecular weight 6863.5 g/mol,Extinction,coeficient 229700.0 l/(molcm)SXJ,PCR,体系,premix,体系,Taka Ra Taq,dNTP mixture,PCR buffer,PEGFP-N3,100ng,Primer 1,0.2-1.0uM,Primer 2,0.2-1.0uM,ddH,2,O,补足,50uL,PCR,反应条件,95,3min,98,10s,60,30s,72,1min,72,5min,4,循环,35,次,02,01,03,加入样品与,buffer,混匀，短暂离心,孵育,22,3h,连接,01,02,03,04,05,质粒的转化,感受态细胞冰浴融化,加入质粒，混匀，冰浴,菌液热激,90s,后冰浴,2min,加,SOD,，,37,摇菌,2000rpm/min 3min,涂布,涂布后，适当培养，挑取单克隆大肠杆菌菌落，进行检验。,挑菌落,镜检,在荧光显微镜下可看见发绿色荧光的大肠杆菌即为实验成功。,