(自创)基因工程的基本操作程序

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因,工,工程,的,的基,本,本操,作,作程,序,序,1,、目,的,的基,因,因的,获,获取,2,、基,因,因表,达,达载,体,体的,构,构建,3,、将,目,目的,基,基因,导,导入,受,受体,细,细胞,4,、目,的,的基,因,因的,检,检测,与,与鉴,定,定,基因,工,工程,基,基本,操,操作,的,的四,个,个步,骤,骤,有了,目,目的,基,基因,，,，我,们,们才,能,能赋,予,予一,种,种生,物,物以,另,另一,种,种生,物,物的,遗,遗传,特,特性,。,。,使目,的,的基,因,因在,受,受体,细,细胞,中,中稳,定,定存,在,在，,并,并可,进,进行,遗,遗传,、,、表,达,达和,发,发挥,作,作用,载体,进,进入,受,受体,细,细胞,稳,稳定,表,表达,，,，才,能,能实,现,现一,种,种生,物,物的,基,基因,在,在另,一,一种,生,生物,中,中的,转,转化,。,。,才能,确,确定,目,目的,基,基因,是,是否,真,真正,在,在受,体,体细,胞,胞中,稳,稳定,遗,遗传,和,和正,确,确表,达,达。,一、,目,目的,基,基因,的,的获,取,取,(,一,),、目,的,的基,因,因主,要,要是,_,也可,以,以是,一,一些,具,具有,调,调控,作,作用,的,的因,子,子。,编码,蛋,蛋白,质,质的,结,结构,基,基因,请举,出,出三,个,个以,上,上的,例,例子,（二,）,）、,获,获取,目,目的,基,基因,的,的常,用,用方,法,法有,哪,哪些,?,请阅,读,读,P9,第一,和,和二,两,两段,1,、从,基,基因,文,文库,获,获取,目的,基,基因,2,、利,用,用,PCR,技术,扩,扩增,目的,基,基因,3,、人,工,工合,成,成,目的,基,基因,已知序列,未知,序,序列,一、,目,目的,基,基因,的,的获,取,取,（一,）,）从,基,基因,文,文库,中,中直,接,接获,取,取,1.,基因,文,文库,：,：概念,见,见,P9,2.,基因,文,文库,的,的分,类,类,:,按外,源,源,DNA,片段,的,的来,源,源分,类,类,种类,基因,组,组,DNA,文库,：,：含有,一,一种,生,生物,的,的全,部,部基,因,因,部,分,分,基,基,因,因,文,文,库,库,：,：只,包,包,含,含,了,了,一,一,种,种,生,生,物,物,的,的部,分,分基,因,因,，,，,如,：,：,cDNA,文,库,库,3.,基,因,因,文,文,库,库,的,的,目,目,的,的,为,了,了,在,在,不,不,知,知,目,目,的,的,基,基,因,因,序,序,列,列,的,的,情,情,况,况,下,下,，,，,便,便,于,于,获,获,得,得,所,所,需,需,的,的,目,目,的,的,基,基,因,因,。,。,4.,获,取,取,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,根,根,据,据,：,：,见,课,课,本,本,P9,注,意,意,：,：,基,因,因,文,文,库,库中,不,不,是,是,直,直,接,接,保,保,管,管,相,相,应,应,基,基,因,因,，,，,而,而,是,是保,存,存,受,受,体,体,菌,菌，,菌,菌,中,中,含,含,基,基,因,因,。,。,提,取,取,某,某,种,种,生,生,物,物,的,的,全,全,部,部,DNA,用,适,适,当,当,的,的,限,限,制,制,酶,酶,切,切,一,定,定,大,大,小,小,的,的,DNA,片,段,段,将,DNA,片,段,段,与,与,载,载,体,体,连,连,接,接,导,入,入,受,受,体,体,菌,菌,中,中,储,储,存,存,基,因,因,组,组,文,文,库,库,5.,基,因,因,文,文,库,库,的,的,构,构,建,建,方,方,法,法,之,之,一,一,（,1,）,直,直,接,接,分,分,离,离,法,法,(,鸟,枪,枪,法,法,),某,种,种,生,生,物,物,的,的,单,单,链,链,mRNA,单,链,链,互,互,补,补,DNA,双,链,链,cDNA,片,段,段,导,入,入,受,受,体,体,菌,菌,中,中,储,储,存,存,与,载,载,体,体,连,连,接,接,cDNA,文,库,库,反,（,（,逆,逆,）,）,转,转,录,录,酶,酶,DNA,聚,合,合,酶,酶,反,转,转,录,录,法,法,：,：,cDNA,的,合,合,成,成,流,流,程,程,图,图,解,解,5.,基,因,因,文,文,库,库,的,的,构,构,建,建,方,方,法,法,之,之,基,因,因,组,组,DNA,文,库,库,cDNA,文,库,库,基,因,因,组,组,DNA,文,库,库,与,与,cDNA,文,库,库,的,的,比,比,较,较,PCR,技术扩,增,增与,DNA,复制的,比,比较,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,DNA,双链复,制,制（碱,基,基互补,配,配对）,四种脱,氧,氧核苷,酸,酸,模板、,能,能量、,酶,酶,DNA,在高温,下,下变性,解,解旋,解旋酶,催,催化,体外复,制,制,细胞核,内,内,热稳定,的,的,DNA,聚合酶,细胞内,的,的,DNA,聚合酶,大量的,DNA,片段,形成整,个,个,DNA,分子,模板,DNA,95,PCR,的基本,原,原理,PCR,反应条,件,件,PCR,过程,PCR,的特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,PCR,的基本,原,原理,PCR,反应条,件,件,PCR,过程,PCR,的特点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,PCR,的基本,原,原理,PCR,反应条,件,件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,第,2,轮开始,PCR,的基本,原,原理,PCR,反应条,件,件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR,的基本,原,原理,PCR,反应条,件,件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,思考？,1,个,DNA,分子进,行,行,PCR,扩增,循环,4,次，,理论上,至,至少需,要,要几个,引,引物？,2,（,2,n,-1,）,(n,为循环,次,次数,),（,2,4,-1,）,2=30,（三）人,工,工合成,已知其序,列,列,已知其,mRNA,的序列,已知其翻,译,译产物的,氨,氨基酸序,列,列,基因比较,小,小，核苷,酸,酸序列又,已,已知。,DNA,合成仪,目的基因,的,的,mRNA,单链,DNA,(cDNA,）,双链,DNA,(,即目的基,因,因,),反转录,合成,1,）反转录,法,法：,以目的基,因,因转录成,的,的信使,RNA,为模板，,反,反转录成,互,互补的单,链,链,DNA,，然后在,酶,酶的作用,下,下合成双,链,链,DNA,，从而获,得,得所需的,基,基因。,蛋白质的,氨,氨基酸序,列,列,mRNA,的核苷酸,序,序列,结构基因,的,的核苷酸,序,序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2,）根据已,知,知的氨基,酸,酸序列合,成,成,DNA,法：,人工合成,的,的目的基,因,因的具体,方,方法,从基因文,库,库中获取,利用,PCR,技术扩增,利用化学,方,方法人工,合,合成,归纳：获,取,取目的基,因,因的方法,科学家在,培,培育抗虫,棉,棉时，经,历,历了多次,失,失败，才,获,获得成功,。,。,起初把苏,云,云金芽孢,杆,杆菌的抗虫基因插入载体,质,质粒中，,然,然后导入,棉,棉花的受,精,精卵中，,结,结果抗虫,基,基因在棉,花,花体内没,有,有表达。,然后在插,入,入抗虫基,因,因的质粒,中,中插入启动子,(,抗虫基因,首,首端,),，导入棉,花,花受精卵,，,，长成的,棉,棉花植株,还,还是没有,抗,抗虫能力,。,。科学家,又,又在有启,动,动子、抗,虫,虫基因的,质,质粒中插,入,入终止子,(,抗虫基因,末,末端,),，导入棉,花,花受精卵,，,，结果成,长,长的植株,，,，有了抗,虫,虫能力。,资 料,:,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,它们各自,有,有什么作,用,用？,步骤二：,基因表达,载,载体的构,建,建,核心,调节基,因,因,操纵基,因,因,结构基因,RNA,聚合酶,半乳糖苷,酶,酶,酶,酶,RNA,聚合酶,启动子,RNA,聚合酶,启动子,：位于基因,首,首端的一,段,段特殊的,DNA,片断，它,是,是,RNA,聚合酶识,别,别和结合,的,的部位，,有,有了它才,能,能驱动基,因,因转录出,mRNA,，最终获,得,得蛋白质,。,。,为什么要,构,构建基因,表,表达载体,呢,呢？,目的：,所需物质,：,：,使目的基,因,因在受体,细,细胞中稳,定,定存在，,并,并且可以,遗,遗传给下,一,一代，同,时,时使目的,基,基因能够,表,表达和发,挥,挥作用。,基因工程,技,技术路线,（二）方,法,法,将目的基,因,因导入,植物细胞,将目的基,因,因导入,动物细胞,将目的基,因,因导入,微生物细,胞,胞,农杆菌转,化,化法,基因枪法,花粉管通,道,道法,显微注射,法,法,感受态细,胞,胞,（,1,）农杆菌,转,转化法,特点：,易感染双,子,子叶植物,和,和裸子植,物,物，对大,多,多数单子,叶,叶植物没,有,有感染能,力,力,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以,转移,到受体细,胞,胞，并,整合,到受体细胞,染,染色体的,DNA,上。,转化过程,:,Ti,质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞,染,染色体,DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,基因枪法,又,又称微弹,轰,轰击法，,是,是利用压缩,气,气体产生,的,的动力，将包裹,在,在金属颗,粒,粒表面的,表,表达载体,DNA,打入受体,细,细胞中，使目的,基,基因与其,整,整合并表,达,达的方法,。,。,（,2,）基因枪,法,法,适用于单子叶植,物,物,（,3,）花粉通,道,道法,植物花粉,在,在柱头上,萌,萌发后，,花,花粉管要,穿,穿过花柱,直,直通胚囊,。,。花粉管,通,通道法就,是,是在植物,受,受粉后，花粉形成,的,的花粉管,还,还未愈合前，剪去柱头，然,后,后，滴加,DNA,（含目的,基,基因），,使,使目的基,因,因借助花,粉,粉管通道,进,进入受体,细,细胞。,适用于被子植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,2.,将目的基,因,因导入动,物,物细胞,（,1,）方法：,显,显微注射,法,法,（将基因,表,表达载体,提,提纯，用,显,显微,注射仪注,射,射到,受精卵中）,思考：为,什,什么要用,受,受精卵而,不,不用体细,胞,胞？,（,2,）操作程,序,序,:,提纯含目,的,的基因表,达,达载体,取受精卵,显微注射,移植到输,卵,卵管或子,宫,宫,受精卵发,育,育,新性状动,物,物,常用法：,Ca,2+,处理,常用菌：大肠杆,菌,菌,微生物作,受,受体细胞,原,原因：,繁殖快、,多,多为单细,胞,胞、遗传,物,物质相对,少,少,过程：,Ca,2+,处理大肠,杆,杆菌,感受态细,胞,胞,表达载体,与,与感受态,细,细胞混合,感受态细,胞,胞吸收,DNA,3.,将目的基,因,因导入微,生,生物细胞,思考：为,什,什么要用,Ca,2+,处理受体,细,细胞？,用,Ca,2,处理，增,加,加细菌细胞壁的通透性,受体生物,植物,动物,微生物,受体细胞,导入方法,受精卵,体细胞,受精卵,细胞,/,个体,农杆菌转,化,化法,基因枪法,花粉管通,道,道法,显微注,射技术,用,Ca,2+,处理成感,受,受态细胞,采用基因,工,工程的方,法,法培育抗,虫,虫棉，下,列,列导入目,的,的基因的,作,作法正确,的,的是（,）,）,A.,将毒素蛋,白,白注射到,受,受精卵中,B.,将编码毒,素,素蛋白的,DNA,序列，与,质,质粒重组,，,，导入细,菌,菌，用该,细,细菌感染,棉,棉的体细,胞,胞，再进,行,行组织培,养