第八章 免疫研究的动物实验方法

*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第八章 免疫研究的动物实验方法,第一节 动物免疫血清的制备方法,一、试验准备（一）动物的选择 用于制造免疫血清的动物，首先要求健康、体壮，对免疫原刺激反应性好。其次是血清采集方便，收获量大。还要考虑操作方便，易于得到。常用的动物有兔、山羊、绵羊、鸡、豚鼠等。具体选择时，应考虑尽可能使用,SPF,动物,、,清洁动物，并且是非免疫动物。大动物要求未发生过传染病。动物的年龄，要求青壮年。大量生产免疫血清一般多选用马、牛进行。,（二）抗原处理 抗原是一类能刺激机体产生抗体，且能与抗体发生特异性结合反应的物质。大多数蛋白质如细菌、病毒及其代谢产物（毒素等）和异种血清等具有良好的免疫原性，是,完全抗原,。而绝大多数多糖、类脂和一些分子量小的蛋白质、多肽及一些化学物质，因缺乏免疫原性称之为,不完全抗原或半抗原,。对于半抗原必须进行适当处理。1、载体的选择：载体是指与半抗原结合后，能促使半抗原具备免疫原性的大分子物质，如血清蛋白、球蛋白等。最常用的是血清白蛋白。2、连结方法：采用化学的方法，使半抗原结合到载体上，并成为载体蛋白的功能团，即抗原决定簇。连结时：不应造成半抗原的结构变化，也不能使蛋白载体变性。,(三）佐剂的种类与制备,佐剂：是指能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答的一类物质。,1、佐剂的标准：（1）应无致癌作用及辅助致癌作用，不能诱导和促进肿瘤形成。（2）应无毒性。（3）应具有一定的吸附能力。（4）具有极高的纯度。（5）应能为动物降解吸收，不宜长期留在体内或诱发组织损伤。（6）不含有与动物有交叉反应的抗原物质。（7）不应诱发自身超敏性，也不应与免疫抗体形成有害的免疫复合物。（8）应性质稳定，能长期贮存。,2、佐剂的种类：（1）油乳佐剂：佛氏佐剂、白油佐剂等。（2）胶体佐剂：氢氧化铝胶、明矾佐剂。（3）合成佐剂：溴化十八烷基三甲基铵（4）微生物佐剂：结核分枝杆菌、葡萄球菌、百日咳杆菌等。（5）动物源佐剂：蜂胶等。（6）植物源佐剂：某些中草药、植物的提取物等。（7）核酸及其类似物：,DNA、RNA、,多核苷酸等。3、常用佐剂的制备：,二、免疫程序与效价测定（一）免疫程序制取不同抗原的免疫血清所采用的免疫程序不同，但基本遵循这样的原则：,基础免疫,增强免疫,检查抗体滴度,采集,1、免疫途径：基础免疫，一般选择皮内、皮下注射或肌肉注射。抗原来源困难的，选择皮内多点注射。加强免疫多选用皮下、肌肉或静脉注射。2、佐剂选择：抗原免疫原性差的多选择油乳佐剂及免疫增强剂等，抗原免疫原性较好的选择一般佐剂。基础免疫时加佐剂，而加强免疫时不加佐剂。3、抗原的选择：基础免疫多选用灭活或弱毒抗原，抗体产生后，可用强毒或加大攻击量。,三、免疫血清的采集与提纯（一）免疫血清的采集抗体效价合格后，即可收集动物血清。可以一次性放血，也可多次采集。1、采血方法2、免疫血清的收集（二）免疫球蛋白的分离与提纯 盐析脱盐提纯,第二节 小鼠单克隆抗体的制备原理,单克隆抗体,（,Monoclonal Antibody,，,McAb,）即单个,B,淋巴细胞克隆所分泌的抗体。,抗体主要由机体的,B,淋巴细胞合成，每个,B,淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的,B,细胞。被激活的,B,细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆。如果选出一个合成一种抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞所合成的抗体即为单克隆抗体。,单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。,单克隆抗体的制备是将免疫淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经过培养、筛选和克隆化，,建立既能分泌针对预定抗原的特异性单克隆抗体，又能无限制增殖的杂交瘤细胞系,，用来生产单克隆抗体，该项技术称为,淋巴细胞杂交瘤技术。,杂交瘤抗体技术的基本原理,:,是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的,小鼠脾,淋巴细胞,和,小鼠,骨髓,瘤细胞,。,脾,淋巴细胞,的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长，,小鼠骨髓瘤细胞,则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有,B,细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。,建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的,B,细胞，通常来源于,免疫动物的脾细胞。,脾是,B,细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有,肿瘤细胞,才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。,多发性骨髓瘤,是,B,细,胞,系,恶性肿瘤,，所以是理想的脾细胞融合伴侣。目前常用的,B,细胞瘤株有：,P3-X63-Ag8(KhlerandMilstein,，,1975),，,P3-NSI/1-Ag4-1(KhlerandMilstein,，,1976),，,X63-Ag8.563(Kearneyetal,，,1979),，,Sp2/0-Ag14(Schulmanetal,，,1978),等，这些,细胞株皆为,HAT,敏感细胞株,。,使用,细胞融,合剂,造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。,聚乙二醇,（,PEG1000,2000,）是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为,40,（,W/V,）。,细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。,正常的脾细胞在培养基中存活仅,5,7,天,，无需特别筛选，,细胞的多聚体形式也容易死去,。而,未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除,。,细胞,DNA,合成一般有两条途径。主途径是由糖和,氨基酸,合成,核苷酸,，进而合成,DNA,，,叶酸,作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在,次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷,存在的情况下，经,次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（,HGPRT,）,和,胸腺嘧啶核苷激酶（,TK,）,的催化作用合成,DNA,。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：,次黄嘌呤（,hypoxanthine,，,H,）、,氨基嘌呤,（,aminopterin,，,A,）和,胸腺嘧啶核苷（,thymidine,，,T,），,所以取三者的字头称为,HAT,培养基,。氨基嘌呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成,DNA,，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶,缺失的（,HGPRT,）细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的,遗传,性能,，可在,HAT,培养基中长期存活与繁殖,在动物免疫中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇，一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答，实质是众多,B,细胞群的抗体分泌。而,针对目标抗原表位的,B,细胞只占极少部分,。由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体，需仔细筛选去除。,筛选过程一般分为两步进行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。,将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在,0,至数个细胞之间（,30,的孔为,0,才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清以,ELISA,法,选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作,克隆化,。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的,ELISA,找,出针,对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。,第三节 肿瘤组织移入动物体内的方法,一、人体肿瘤组织移植入动物体内的方法动物：免疫缺陷动物。裸小鼠、裸大鼠等。移植方法：1、肿瘤组织块移植2、肿瘤组织悬浮液移植3、肿瘤组织培养液移植,移植途径：1、皮下移植2、肾包膜移植3、原位移植,二、动物间肿瘤组织的移植方法 动物间肿瘤组织移植术可分为两类：免疫缺陷动物间肿瘤移植和非免疫缺陷动物间肿瘤移植。,免疫缺陷动物间肿瘤移植：,将已在裸鼠体内成功生长的肿瘤以组织块或细胞方式，继续移植到其他裸鼠的体内进行传代。,非免疫缺陷动物间肿瘤移植：,将在正常动物体内生长的肿瘤，以组织块或细胞方式进行传代给正常动物。一般来说，该肿瘤组织来源于该品系动物本身，而且局限于在该品系动物间相互移植传代才能成功，在异种动物体内则不能生长。,第四节 动物皮肤移植方法,鉴定动物组织相容性基因是否一致。是遗传监测常用的很有意义的一种方法。大、小鼠常用尾皮移植和背皮移植。移植后必须观察100天。移植后接受超过100天：遗传高度一致移植后前三周内排斥：,H-2,复合体显著差异移植后发生慢性排斥：非,H-2,区域差异,一、背部皮肤移植方法常用于小鼠（一）材料准备（二）操作方法1、固定小鼠2、取皮与植片：取直径5-10,mm,的皮肤左右各一块。两只小鼠左片做自体移植，右片互相交换。注意：毛根方向相反3、包扎：4、观察,（,1,）移植失败（,2,）急性排斥：,23W,（,3,）慢性排斥：,3W,后（,4,）移植存活,二、尾部皮肤移植方法适合于大鼠、小鼠。雌性为宜。,异体皮肤移植是利用免疫系统识别“自己”与“异已”的特性，进行组织相容性鉴定的方法。,优点,：敏感性强，经济；可监测多,H,基因。,缺点,：时间长，为监测非,H-2,组织相容基因的差异需观察,100,天的时间；植片脱落原因不定。,与背部皮肤移植法相比，尾部皮肤移植法有何优点？尾部皮肤移植法 背部皮肤移植法快速,约,23,分钟,需,2030,分钟,简便,不需剃毛、易包扎、创伤小 剃毛、难包扎、创伤大,节省,可接受异体,24,块皮片 只接受,1,块皮片,