真核细胞基因组结构与功能

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,真核细胞基因组结构与功能,染色体的结构,染色体研究的历史背景,染色体的化学组成,核小体的结构,染色体研究的历史背景：,1865年，Mendel（奥地利）,历时八年，完成了植株（豌豆）杂交试验，在此基础上总结出二个著名遗传学定律：,分离定律,独立分配定律,“遗传因子”,（genetic factor）是 Mendel 定律的基本思路，每一植株的各种相对性状都来源两个相同的“遗传因子”，它们有显性和隐性之分， “遗传因子”含义是指决定遗传性状的基本遗传单位,遗传因子,染色体,存在于细胞核中，经适当染色后可见由细丝状颗粒物质所组成，一般在细胞分裂时才能看到,在不同物种的细胞中，它们的数目不一样，但总是以二条成对的同源（homologous）染色体的形式存在，且数目恒定,细胞周期,（cell cycle）,细 胞 产 生 到 分 裂 成 子 细 胞 之 间 的 过 程,大 肠 杆 菌 约 每 30 分 钟 分 裂 一 次 ， 其 中 大 约 29 分 钟 花 在 复 制 DNA,果 蝇 的 胚 胎 细 胞 周 期 只 有 8 分 钟,大 部 分 成 长 中 的 动 植 物 细 胞 要 花 10 - 20 个 小 时 才 分 裂 完 毕,染色体是遗传的物质基础,体细胞增殖,有丝分裂（mitosis）方式,染色体对自身复制,姐妹染色体（sister chromatid）,姐妹染色体一分为二进入子细胞,细胞分裂,染色体是遗传的物质基础,生殖细胞增殖,减数分裂（meiosis）方式,同源染色体分别进入新的子代细胞而产,生生殖细胞配子（精子或卵子），配,子只含有体细胞一半的染色体数,配子结合成合子后又恢复到体细胞的染,色体数，一个来自父本，一个来自母本,减数分裂,染色体与“遗传因子”极其相似,二者均成对存在，且其中的每个成员分别来自父、母亲代,产生配子时，配子只含“遗传因子”（等位基因）中的一个或染色体对中的一条,非等位基因及非同源染色体均可自由组合到配子中,在上述基础上，Sutton和Boveri（1902-1903）提出了,染色体遗传学,认为：染色体是“遗传因子”的携带者,基因连锁和交换规律,Morgan：发现了伴性基因，总结出了遗传学上著名的基因连锁（linkage）和交换（crossing-over）规律,通过测定连锁的回交试验，证实了基因在染色体上呈线性排列的事实,产生了遗传学上最早的,基因定位线性遗传图,Homologous chiasma,Conversion and Crossover,染色体的主要化学成分,DNA,蛋白质,RNA,生化研究表明：上述三类组成染色体的化学成分中，蛋白质含量约为DNA的二倍，根据组成蛋白质的氨基酸特点分为组蛋白和非组蛋白两类。RNA含量很少，还不到DNA量的10%,组蛋白（histones）,染色体中的碱性蛋白质,特点：富含二种碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸）,根据这两种氨基酸在蛋白质分子中的相对比例将组蛋白分为五种小类型,五种组蛋白比较,组蛋白,组蛋白的等电点（pI）在7.5-10.5之间，所含的强极性氨基酸使组蛋白带上大量电荷，成为组蛋白与DNA结合及蛋白质之间的相互作用的主要化学力之一,根据所含碱性氨基酸的相对比例划分为三种类型：富精氨酸组蛋白（H,3,和H,4,），稍富赖氨酸组蛋白（H,2A,和H,2B,）及极富赖氨酸组蛋白（H,1,）,组蛋白,五种组蛋白的氨基酸全顺序均已确定。 H,3,和 H,4,的序列在各种属之间极少有差异，这种生物进化上的高度保守性预示着其功能的重要性。其它三种组蛋白在不同种属之间存在着较大的差异,组蛋白对染色体中DNA的包装有十分重要的作用,组蛋白,非组蛋白（non-histone protein，NHP）,染色体中组蛋白以外的其它蛋白质,是一大类种类繁杂的各种蛋白质的总称,估计总数在 300-600 之间,分子量范围为7-80kD,非组蛋白功能,1. 参与并调控基因表达,参与基因复制、转录及核酸修饰的酶,类（如各种 DNA和 RNA聚合酶等）,就是一类重要的非组蛋白,参与转录调控的蛋白质,2. 维持染色体的高级结构,非组蛋白中的核基质蛋白对于维持染,色体的高级结构是必不可少的。,染色体的包装,核小体（nucleosome）,1974年，Kornberg 发现核小体,核小体是所有真核生物染色体的,基本结构单位,核小体的研究（一）,电镜观察,破裂的间期细胞流出的染色质，可见染色质纤维呈非连续性颗粒状，就像一条细线上串联着许多有一定间隔的小珠状颗粒（核小体）,用小球菌,核酸酶处理,提取的染色质，可得到单个的核小体颗粒,对染色质进行酶解处理，通过,凝胶电泳鉴定,，发现：产物是一系列不同长度的DNA片段，且这些片段之间有一个200 bp左右的“阶差”,核小体的研究（二）,对核小体多聚体的研究，获得的结果是：相邻多聚体之间的DNA“阶差”等于核小体单体中的DNA长度（200 bp 左右），且,多聚体分子量总是单体分子量的整倍数,以密度梯度离心法制备核小体单体，对其中的蛋白质进行化学分析得知，每一个单体中含有H,2A,、H,2B,、H,3,和H,4,各二分子（它们构成一个八聚体），H,1,一分子,核小体是染色体的基本结构单位,核小体重复单位所有真核生物中具有普遍意义的染色体基本结构,不同生物（或同种生物的不同细胞）的核小体，其,DNA,片段长度的有所差别,一种细胞通常有特定的平均值，一般为180-200,bp,每一核小体所含的,DNA,与组蛋白的量大致相等,核小体结构的研究（一）,核酸酶酶解实验结果：,核小体由核心颗粒（core particle）和连接区DNA（linker DNA）二部分组成,核小体单体被小球菌核酸酶处理后，随着时间延长，其降解产物（DNA片段）会逐渐缩短，从 200 bp降至 146 bp至此变为很难进一步降解的稳定状态,核小体结构的研究（二）,对此稳定降解产物进行分析，证明它是由146 bp 的DNA片段和 H,2A,、H,2B,、H,3,和H,4,各二分子组成，这种结构称为核心颗粒（core particle）,H,1,总是随着核心颗粒的形成而消失，通常是在DNA被降解至160 bp以后，提取物中H,1,丢失，提示H,1,位于“裸露”DNA与核心颗粒的毗邻区,核小体结构的研究（三）,核心颗粒外，“裸露”的DNA长度为60bp左右，称为连接区DNA （linker DNA）,连接区DNA的长度在不同物种差异较大，其范围在10-140bp,核小体结构的研究（四）,生物物理的有关研究说明：DNA盘绕在组蛋白八聚体的周围，呈很有规律的螺旋状,根据上述结果，我们对核小体的结构可作这样的描述：,染色质中的DNA双螺旋链，等距离缠绕组蛋白八聚体形成众多核心颗粒，各颗粒之间为带有H,1,组蛋白的连接区DNA。,组成染色质的重复结构单位就是核小体,核小体结构（一）,1.,核心颗粒外观呈椭圆形，轴比为,0.5，颗粒直径11nm，高5.5nm，,绕颗粒的 DNA 长度为 50 nm（146bp），连接区 DNA 长度为,20nm（约60bp）,核小体结构（二）,2. （H,2A,H,2B,H,3,H,4,）,2,构成的致密八,聚体位于颗粒中央，外绕 1.75 圈左走向,的 DNA 链，每圈约85bp DNA，螺旋间,距为2.8 nm，组蛋白主要为-螺旋，处,于DNA双螺旋的大沟中，靠静电引力与,DNA保持稳定结合。由于空间构象的关,系，缠绕在蛋白八聚体上的DNA链并非,所有部分都与组蛋白结合,核小体结构（三）,3. 相邻核心颗粒由连接区 DNA 连接，其,伸展长度约20 nm（据认为天然状况下,由于核小体是紧挨着的，这一空间距离,可能并不存在）。H,1,组蛋白结合在靠核,心颗粒的连接区DNA上,染色体的包装超螺旋结构,核小体：染色体DNA的一级包装,由直径2nm的DNA双螺旋链绕组蛋白形成直径11nm 的核小体 “串珠” 结构，若以每碱基对沿螺旋中轴上升距离为 0.34 nm计，200bp DNA（一个核小体的DNA片段）的伸展长度为 68 nm，形成核小体后仅为11 nm（核小体直径），其长度压缩了6-7倍,染色体的包装超螺旋结构,螺线管纤维（solenoidal fiber）：染色体DNA二级包装,由6个核小体盘绕形成一种中空螺线管，其外径为30 nm，因此，螺线管的形成使DNA一级包装又压缩小6倍,若以充分伸展的DNA双螺旋论，每个螺线管包含了408 nm（668 nm）长度的DNA链，而每圈螺线管的长度几乎等于核小体直径，即11nm，故染色体的二级包装相当于将DNA长度压缩了近40倍,染色体的包装超螺旋结构,环状螺线管：染色体DNA的三级的包装,电镜显示，由螺线管纤维缠绕在一个由某些非组蛋白构成的中心轴（centralaxis）骨架上形成的。这显然使螺线管纤维得到了较大程度的压缩,染色体的包装超螺旋结构,三级包装后，DNA链被压缩的程度仍远远不足以形成能被细胞核容纳的染色体，因此，环状螺线管纤维需进一步包装,从环状螺线管到包装形成染色体，是DNA压缩程度最高的阶段，估计在200-240倍。,经各级包装后染色体DNA总共被压缩了数千倍（8100多倍）,染色体的包装,真核生物,染色体基因组的结构和功能,真核生物的基因组比较庞大,人的单倍体基因组,3.1610,9,bp,按1000个碱基编码一种蛋白质计：,理论上，可有300万个基因,实际上，人细胞中所含基因总数大概不会超过10万个,说明：人类细胞基因组中有许多DNA序列并不转录成mRNA用于指导蛋白质的合成,真核生物基因组特点,1.,真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成,染色体，储存于细胞核内， 除配子细胞,外， 体细胞内的基因的基因组是双份的,（即双倍体,diploid），即有两份同源的,基因组,2.,真核细胞基因转录产物为单顺反子。一,个结构基因经过转录生成一个mRNA分,子，再翻译生成一条多肽链,真核生物基因组特点,3.,存在重复序列，重复次数可达百万次以,上,4.,基因组中不编码的区域多于编码的区域,5.,大部分基因含有内含子，因此，基因是,不连续的（断裂基因，split gene）,6.,基因组远远大于原核生物的基因组，具,有许多复制起始点，而每个复制子的长,度较小,真核生物基因结构示意图,高度重复序列,high repeated sequence,高度重复序列在基因组中重复频率高，可达百万（10,6,）以上，因此复性速度很快,在基因组中所占比例随种属而异，约占10-60，在人基因组中约占 20 。高度重复顺序又按其结构特点分为三种,高度重复序列,种类,反向重复序列,卫星DNA,较复杂的重复单位组成的重复顺序,功能,倒位（反向）重复序列,reverse repeated sequence,这种重复顺序复性速度极快，即使在极稀的DNA浓度下，也能很快复性，因此又称零时复性部分，约占人基因组的5,反向重复序列由两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成。变性后再复性时，同一条链内的互补的拷贝可以形成链内碱基配对，形成发夹式或“+”字形结构,倒位（反向）重复序列,倒位（反向）重复序列,倒位重复（即两个互补拷贝）间可有一到几个核苷酸的间隔，也可以没有间隔没有间隔的又称回文（palimdrome）,回文结构约占所有倒位重复的三分之一,卫星DNA,satellite DNA,重复顺序：由2-10bp组成重复单位，重复单位成串排列而成,由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA 分开，因而称为卫星DNA （或随体DNA）,在人细胞组中，卫星 DNA约占 5-6,按其浮力密度不同，人的卫星DNA可分为、四种,卫星DNA,卫星DNA,果蝇的卫星DNA顺序已经搞清楚，可分为三类，这三类卫星DNA都是由7bp组成的高度重复顺序：,卫星为：5 ACAACTT 3,卫星为：5 ACAAATT 3,蟹的卫星DNA为只有AT两个碱基的重复顺序组成,较复杂的重复单位组成的重复顺序,这种重复顺序为,灵长类动物,所独有,用限制性内切酶 Hind 消化非洲绿猴DNA，可以得到重复单位为172 bp的高度重复顺序，这种顺序大部份由交替变化的嘌呤和嘧啶组成。有人把这类称为卫星DNA,人的卫星DNA更为复杂，含有多顺序家族,高度重复顺序的功能,1. 调节反向序列常存在于DNA复制起点区的附近。另外，许多反向重复序列是一些蛋白质（包括酶）与DNA的,结合位点,2. 参与基因表达的调控DNA的重复顺序可以转录到核内不均一RNA（hnRNA）分子中，并形成发夹结构，这对,稳定RNA分子,，免遭分解有重要作用,高度重复顺序的功能,3.,参与转位作用,几乎所有转位因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp 到1400bp。由于这种顺序可以形成回文结构，因此在转位作用中既能连接非同源的基因，又可以被参与转位的特异酶所识别,高度重复顺序的功能,4.,与进化有关,不同种属的高度重复顺序的核苷酸序列不同，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。如：,人,与,非洲绿猴,的卫星 DNA长度仅差1个碱基（前者为171 bp，后者为172bp），而且碱基序列有65是相同的，这表明它们来自共同的祖先,高度重复顺序的功能,5. 同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，即,DNA指纹,6. 卫星 DNA 成簇的分布在染色体着丝粒附近，可能,与减数分裂时染色体配对有关,，即同源染色体之间的联会可能依赖于具有染色体专一性的特定卫星DNA顺序,中度重复序列,middle repeated sequence,Alu家族,Kpn家族,Hinf,家族,rRNA,基因,多聚,d,d,家族,组蛋白基因,中度重复顺序,中度重复序列：在基因组中重复数十至数万（100拷贝），大部份组蛋白基因串联重复形成基因簇,组蛋白基因,在果蝇和非洲爪蟾中，5 种组蛋白也排成一个重复单位，也存在间隔区，组蛋白基因的转录方向不一样。多个重复单位形成串联重复排列,哺乳动物，组蛋白基因一般不再形成重复单位，而呈散在分布或集成一小群,尽管组蛋白基因在基因组中的排列和分布在不同生物之间相差甚大，但所有组蛋白基因都不含内含子，而且组蛋白基因序列都很相似，从而编码的组蛋白在结构上和功能上也极为相似,组蛋白基因,基因组中存在大量重复序列用以编码组蛋白是有其重要意义的,DNA复制时，组蛋白也要成倍增加，而且往往在DNA合成一小段后，组蛋白马上就要与其相结合，这要求在较短的时间内合成大量的组蛋白，因而需要有大量的组蛋白基因存在,超基因,人体基因组中还有几个大的基因簇，也属于中度重复序列的长分散片段。在一个基因簇内含有几百个功能相关的基因，这些基因簇又称为,超基因,（Super gene），如人类主要组织相容性抗原复合体HLA和免疫球蛋白重链及轻链基因都属于超基因,超基因可能是由于基因扩增后又经过功能和结构上的轻微改变而产生的，但仍保留了原始基因的结构及功能的完整性,抗体基因的形成,单拷贝顺序（低度重复顺序）,单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次或数次，因而复性速度很慢,单拷贝顺序在基因组中占 50-80 ，如人基因组中，大约有 60-65 的顺序属于这一类。单拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质,目前尚不清楚单拷贝基因的确切数字，在单拷贝顺序中只有一小部份用来编码各种蛋白质，其他部份的功能尚不清楚,单拷贝顺序（低度重复顺序）,在基因组中，单拷贝顺序的两侧往往为散在分布的重复顺序,由于某些单拷贝顺序编码蛋白质，体现了生物的各种功能，因此对这些序列的研究对医学实践有特别重要的意义,由于其拷贝数少，在DNA重组技术出现以前，要分离和分析其结构和顺序几乎是不可能的,单拷贝顺序（低度重复顺序）,真核生物的结构基因不仅在两侧有非编码区，而且在基因内部也有许多不编码蛋白质的间隔序列（intervening sequences），称为内含子（intron），编码区则称为外显子（exon）,内含子与外显子相间排列，转录时一起被转录下来，然后内含子被切掉，外显子连接在一起成为成熟的mRNA作为指导蛋白质合成的模板,多基因家族与假基因,真核基因组的另一特点就是存在多基因家族（multigene family）,多基因家族是指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因,多基因家族与假基因,多基因家族大致可分为两类：,一类是：基因家族成簇地分布在某一条染色体上，其可同时发挥作用，合成某些蛋白质（如：组蛋白基因家族就成簇地集中在第 7 号染色体长臂 3 区 2 带到 3 区 6 带区域内）,另一类是：一个基因家族的不同成员成簇地分布不同染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质（如珠蛋白基因家族）,多基因家族与假基因,在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因（pseudo gene）,假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等，使这一基因失去活性，成为无功能基因,多基因家族与假基因,假基因往往缺少正常基因的内含子，但两侧有顺向重复序列。人们推测，假基因的来源之一，可能是基因经过转录后生成的RNA前体通过剪接失去内含子形成mRNA，如果mRNA经反转录产生cDNA，再整合到染色体DNA 中去，便有可能成为假基因，因此该假基因是没有内含子的，在这个过程中，可能同时会发生缺失，倒位或点突变等变化，从而使假基因不能表达,自私DNA（selfish DNA）,在哺乳动物包括人体基因组中，存在着大量的非编码顺序。这些顺序中，只有很小一部份具有重要的调节功能，绝大部部分都没有什么特殊功用。在这些DNA序列中虽然积累了大量缺失，重复或其他突变，但对生物并没有什么影响，它们的功能似乎只是自身复制，所以人们称这类DNA为自私DNA或寄生DNA（parasite DNA）。自私DNA也许有重要的功能，但目前我们还不了解,