分子生物学讨论人类基因组DNA提取

,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,人类,DNA,基因组提取,分子生物学第一次讨论,蒋伯岳 朱之苑 崔增桢,1,人类基因组DNA提取的原理,哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备,DNA,，除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞。,2,人类基因组DNA提取的原理,人类基因组,DNA,提取应考虑以下原则：,（,1,）防止和抑制,DNase,对,DNA,的降解；,（,2,）尽量减少对溶液中,DNA,的机械剪切破坏，保持,DNA,分子的完整；,（,3,）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。,3,DNA整体表现为酸性，带负电。是极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇，苯酚，氯仿，乙醚等有机溶剂，形成沉淀。从而被分离提取出来。,蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀，从而被除去。,人类基因组DNA提取的原理,4,人类基因组DNA提取的方法,从全血中提取,从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取,从胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞中提取（常用于产前诊断）,5,葡聚糖悬浮法分离抗凝全血中的白细胞:加2.5 mL 4%葡聚糖溶液于试管中，将5 mL新鲜抗凝全血加于葡聚糖溶液之上，净置30 min后，吸取黄色上清白细胞悬液)，离心得白细胞，洗涤。,酚醇法从全血中提取DNA,6,在5 mL 15 mmol/L TES溶液中悬浮白细胞，加蛋白酶K 250一350 微克，10%SDS 260微升，充分混匀，置37过夜。,酚醇法从全血中提取DNA,7,冷却至4 加等体积Tris饱和酚，充分混匀，4 3 000 r/min离心30 min吸取上层溶液移至另一离心管。加等体积Tris饱和酚，重复上一步Tris饱和酚抽提。,酚醇法从全血中提取DNA,8,加等体积氯仿/异戊醇，充分混匀，4 3 000 r/min离心5 min，吸取上层溶液移至另一离心管。重复数次。,吸取上层溶液至2.5倍体积冷无水乙醇中，轻摇至DNA析出。用75%冷乙醇清洗3一4次。加适量TE溶液溶解DNA。鉴定DNA。,酚醇法从全血中提取DNA,9,EDTA,：,是一种血液抗凝剂，同时抑制核酸酶活性，防止DNA被水解。,SDS,：,10%,（,W/V,）十二烷基硫酸钠：,是一种去污剂，能导致蛋白质变性，从而破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。,酚：,是蛋白质的变性剂，并将变性的蛋白质溶解其中。而DNA则溶解于水相。,氯仿：,是蛋白质的变性剂，促进两相分离，并除去DNA溶液中的酚。,试剂作用,10,蛋白酶,K,溶液：,是一种很强的蛋白水解酶，在SDS中稳定。水解各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类，和脂类，胺类物质）。同时由于RNA酶和DNA酶是蛋白质，也可被水解，从而防止DNA被水解。,无水乙醇：使,DNA,析出,75%,乙醇：洗涤,DNA,沉淀,试剂作用,11,用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。,试剂盒的产生正是为了使实验人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程，所以试剂盒中一般配备有相应的使用说明书，用户按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果。,试剂盒,12,酚氯仿法：相对复杂，需要配置多种试剂，但提取量和纯度有保证，可一次抽取多量静脉血。,试剂盒法：高效，快速，方便，提取DNA相对于酚氯仿法高，但一次抽取DNA量较少。,两种方法的比较,13,限制性核酸内切酶,切割原理、方法及结果分析,1,、定义：,1,、定义,：,限制性核酸内切酶,是可以识别,特定的,核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,进行切割的,一类酶,，简称限制酶。,限制性核酸内切酶的分类及特点,类型 限制性 修饰作用 识别位点 切割位点,型 有 有 特异 识别位点下游,100,到,1000bp,型 有 无 特异 可知、固定,型 有 有 特异 识别位点附近切割,DNA,，,切割位点很难预测。,17,规则：,第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名,第二、三个字母（小写）：该细胞的种名,第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号,例如：,EcoR,、,Hind,等,内切酶的命名,限制性核酸内切酶切割原理,1,、类和类酶：,在同一蛋白质分子中兼有,切割和修饰,（甲基化）作用且,依赖于ATP,的存在。类酶结合于识别位点并随机的,切割识别位点不远处的DNA,，而类酶在,识别位点上切割DNA分子,，然后从底物上解离。,2,、类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它,切割某一特异的核苷酸序列,通常是,4,6,个碱基对、具有回文序列（,palindrome,）的,DNA,片段；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。,一般需要较纯的底物,DNA Mg2+Tri s-HCl,缓冲液，通常在,37,保温以酶解,DNA,。,限制性核酸内切酶图谱分析：同一,DNA,用不同的限制酶进行切割，从而获得各种限制酶的切割位点，由此建立的位点图谱有助于对,DNA,的结构进行分析。,方法：,EcoR I,和,Bgl,有两种类型，即表中的,I,型和,型。,操作方法：,病毒,DNA,的提取和纯化,当繁殖病毒的细胞出现,80%-100%,的细胞病变时,(CPE),，收获并冻融三次使细胞破裂释放出病毒，,3 000r/min,离心,10,分钟，吸出上清，加,10%SDS,至终浓度为,1%,，于,56,水浴作用,30,分钟，加等体积的饱和酚，混匀,10 000r/min,离心,10-15,分钟，取上清反复抽提至界面无蛋白质为止，取上清用乙醚去酚数次，真空除去乙醚，然后加,2.5,倍预冷无水乙醇，沉淀核酸，,12 000r/min,离心后，核酸沉淀再用,70%,乙醇洗涤两次，,pH8.0 TE,缓冲液溶解，取少量用紫外分光光度计测其含量和纯度，其余置,20,贮存备用。,2,、酶切反应,将病毒,DNA,用,TE,溶解为大约,0.5g/l,。然后依次加入,5l 10,酶切缓冲液（,50mmol/L NaCl,，,10mmol/L Tris-HCl pH7.8,，,10mmol/L MgCl2+,，,1mmol/L DTT,），,5l DNA,，,2l,限制性酶,(1-5l/g DNA),，用灭菌双蒸水补足至,50l,，在振荡器上温和振荡几秒钟，然后稍稍离心,(3 000r/mmin),数秒，以使管壁液体集中于管底，,37,恒温水浴中孵育,1,小时，,65,水浴作用,10,分钟，或用,EDTA,终止反应。,TE,缓冲液是,Tris+EDTA,缓冲液,二硫苏糖醇,NE buffer,BSA:,牛血清白蛋白通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。,去离子水,3,、电泳,依据酶切片段的大小选择不同浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶作为支持物进行电泳，同时加入标准,DNA,作分子量参照物，经溴乙锭,(EB),或硝酸银染色，在相应的光源下观察结果并拍摄记录电泳图谱。,以上为酶切反应操作的基本过程。如果进行多酶切反应，则要考虑反应缓冲液要基本适用于所用的各种酶。若两种以上的酶对缓冲液要求不同，如盐浓度要求不同时，先进行低盐要求的酶切反应，再进行高盐要求的反应，对反应温度要求不一的也是先进行低温度酶切，再进行高温度酶切。,什么是琼脂糖凝胶,琼脂糖凝胶电泳技术使用,琼脂糖凝胶,作为固体介质。从海藻提取出的琼脂中可以分离出一种胶状多糖，称为琼脂糖。琼脂糖通常为自色粉末，有时稍带色。它的主要成分为交替连接的,D-,吡喃半乳糖和,3,，,6-,脱水,-L-,吡喃半乳糖基。,琼脂糖分子中含有很多羟基，羟基之间的氢键使琼脂糖分子聚集，成为形成凝胶的主要作用力。,在加热条件下，琼脂糖溶于水，形成溶液。当该溶液的温度降至,45,左右时，多糖链,(,图,3,左部,),通过链间的氢键形成双螺旋结构,(,图,3,中部,),。双螺旋之间通过氢键相连成束，束间再通过氢键作用形成三维网络结构,(,图,3,右部,),，即凝胶,36,。由于维系三维网状结构的作用力主要是氢键，因此能破坏氢键的因素都能破坏琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶三维网络结构中存在大量微孔，这就是,DNA,分子在凝胶中移动的通道。,分子量不同或构型不同的,DNA,分子的电泳速率不同，因此可以分离开来。由于,DNA,本身无色，所以需要加入一种有色指示剂，来帮助人们确定它移动到了什么位置。所用指示剂一般分子量很小，电泳速率较快，跑在泳带的最前端，可以根据它的位置及时终止电泳。实验中还需要加入某种荧光染色剂，它与,DNA,的结合体在紫外光照射下发出荧光，从而将分离出的,DNA,条带显示出来。,图,1,就是加有荧光染色剂的样品在紫外光下拍摄的照片。将实验样品与,DNA,标准样品同时电泳，比对,2,者的条带位置，就可以鉴定分离出的,DNA,的分子量或构型。,琼脂糖凝胶电泳原理,1,、琼脂糖为链状多糖 绳状琼脂糖束大网孔型凝胶,分离、鉴定、纯化,DNA,2,、影响,DNA,迁移率的因素：,DNA,分子的大小、构象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成,1,、琼脂糖为链状多糖 绳状琼脂糖束大网孔型凝胶,分离、鉴定、纯化,DNA,2,、影响,DNA,迁移率的因素：,DNA,分子的大小、构象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成,范海荣，夏永静，孙福成，何青；四种全血基因组DNA提取方法的比较；中国动脉硬化杂志2002年第10卷第6期,陈昆明，夏叶子，章圣辉，陈为安，胡听，杨慧民，何金彩，杨德业；经典酚/氯仿抽提法和纯化试剂盒法提取全血基因组DNA的比较；浙江医学2010年第32卷第5期,熊江霞，朱华庆，王雪，张素梅，陈厚早，储兵卜，丽佳，周青，桂淑玉，汪渊；限制性内切酶酶切及限制性内切酶酶切图谱分析；安徽医科大学学报ISTICPKU-2003年2期,李明云，朱俊杰，邬勇，张春丹，黄福勇；大黄鱼线粒体DNA的限制性内切酶图谱；科技通报ISTICPKU-2006年4期,参考文献,30,