双光子及光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验,浙江大学生命科学学院,仪器与技术服务平台,机型：,Zeiss LSM710 nlo,32,通道阵列,PMT,690-1080nm,可调谐飞秒激光器,激光共聚焦显微镜的非常规应用,利用双光子分辨目标荧光和自发荧光,利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假,转基因材料快速筛选,嘈杂背景下的细胞计数,非线性效应,光刻和深度扫描,模拟近红外光源,GFP,标记水稻根中自发荧光的清除,单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色自发荧光,双光子激发，自发荧光为蓝色,ex 488nm,，,Lambda mode,ex 820nm,lambda mode,GFP,标记水稻根中自发荧光的清除,双光子激发下,GFP,荧光与自发荧光的波长分离，,820nm,激发时，仅采集,493-542nm,区间的信号以保证特异性,Ex 820nm,channel mode,微弱或自发荧光存在下的信号鉴定,Promoter:GFP,载体注射烟草叶片（,lambda mode,成像）,转,GFP,弱表达,转,GFP,不表达,镜下目视特征：,绿色信号被强烈红光掩盖,GFP,和,RFP,弱时无法分辨,Lambda,合成图特征,：,GFP,：绿色偏蓝,自发荧光：绿色偏黄,叶绿素荧光：红色,光谱特征：,GFP,：,主发射峰位于约,518nm,副发射峰位于约,540nm,后者高度约为前者的一半,呈台阶形,自发荧光：,在,560nm,左右对称分布,叶绿素荧光：,625nm,以上强烈信号,GFP,叶绿素,转基因材料的快速筛选,原则：密集预排列待测样,技巧：,lambda,扫描,色彩判别 荧光峰形检查,GFP,蓝绿特征色,GFP,台阶形特征峰,518,540,土壤浸出液中外源,GFP,标记细菌浓度分析,目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系,方法：等比掺入外源,GFP,标记菌体，设置多种环境条件,问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧光的杂质颗粒,解决：,1,固定样品体积,2 lambda,成像检测,GFP,特异荧光,3,最大化,pinhole,非线性效应：碳纳米管,498,518,421,原理：某些材料在双光子激发，会发射波长为激发光一半的荧光,利用不同波长的双光子激光照射可能含碳纳米管的靶向药物，,lambda,扫描发现荧光信号呈现严格的倍频关系,Ex 850,Ex 1000,Ex 1040,光刻和深度扫描,一种人工合成的透明有机晶体，在一定强度的近紫外光下会发生局部变性，从而具有双光子效应,在,2,个不同,Z,坐标下做,bleach,，,ex 458nm,ex 900nm,做,z-stack,，显示多层光刻效果，信号随深度增加而衰减,叶表面蜡质层成像及厚度测定,菲（多环芳烃类）渗透,Ex 700nm,Channel mode,Z-stack,谢谢大家,