实验七细胞骨架观察

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,细胞骨架组分的,荧光染色观察,实验目的,掌握细胞骨架的显示方法,掌握荧光显微镜的使用方法,了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构,背景知识,细胞参量,荧光探针 吸收,/,发射,nm,特性,DNA,和,RNA,Propidum iodide(PI),535/617,红色荧光,嵌入核酸双链间,只能标记死细胞,.,用于 染色体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究,Ethidium bromide(EB)518/605,红色荧光,嵌入核酸双链间,只能标记死细胞,.,用于电泳分析,染色体观察,DAPI 358/461,蓝色荧光,半通透细胞,结合于,DNA,的,AT,碱基对,.,用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察,Hoechst33342 350/461,蓝色荧光,结合于,DNA,的,AT,碱基对,可进入活细胞,用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察,蛋白和抗体的耦联探针,FITC 494/518,绿色荧光,染死细胞,对,PH,值变化不敏感,Texas red 595/615,红色荧光,多参量细胞标记,溶酶体,Neutral red 541/640,红色荧光,探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细胞器,线粒体,Rhodamine 123,507/529,黄绿色荧光,可进入活细胞,阳离子性,摄入快,淬灭快,无毒性,常用荧光探针介绍,狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。,广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。,细胞骨架,2024/11/26,微管,2024/11/26,微丝,2024/11/26,中间纤维,背景知识,用,考马斯亮蓝染,人皮肤成纤维细胞的细胞骨架获得成功。,1982,年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。,当细胞用适当浓度的,triton X-100,溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧密，不容易被去除，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。,细胞骨架研究中常用药物,药物名称,作用,细胞松弛素,B(cytochalasin B,CB),结合在微丝的正端，阻抑其聚合，同时提高临界浓度，最终导致微丝的解聚,鬼笔环肽,(phalloidine),强烈亲和微丝，结合在微丝中,actin,亚单位之间，稳定微丝、促进微丝聚合,秋水仙素（,colchicine,）,阻断微管蛋白组装成微管,紫杉醇（,taxol,）,促进微管的装配，稳定已形成的微管,实验原理,鬼笔环肽,(phalloidin),是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反,只与聚合的微丝结合,而不与肌动蛋白单体分子结合。它,同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。,由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白,因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响,.,此外,较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用,.,因此,用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法,.,G-actin,F-actin,ATP,、,Mg,2+,、高,K,+,、,Na,+,Ca,2+,、低,Na,+,、,K,+,实验步骤,材料：,CHO,（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞,试剂：,1.,PEM,：,50mM pipes(pH6.9),5mM EGTA,5mM MgSO,4,0.225M,山梨醇,2,.0.5%Triton X-100,溶于,PEM,缓冲液中,。,3,.4%,多聚甲醛溶于,PEM,缓冲液中。,取出盖片，于小平皿中,37,预温,PEM,洗,3,次,(,每次,1mL),Triton X-100,处理约,10min(,1mL),37,预温,PEM,洗,3,次,(,每次,1mL),37,预温,4%,多聚甲醛固定细胞,15min(,1mL),37,预温,PEM,洗,3,次,55nM Alex-phalloidin 10,L,湿盒中室温染色,30min,。,37,预温,PEM,洗数,3,次,滴加,10,L,Ho.33342,复染色,用小砂轮切去长方形盖玻片的一角作为标记以便识别细胞面。,细胞密度,60-80%,注意盖玻片的正反面,切勿产生气泡,！,在,parafilm,膜上加,PEM,，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。,避光操作,荧光镜下观察,注意事项,注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；,各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；,荧光观察注意避光操作,节约试剂。,思考题,PEM,缓冲液的作用是什么？,0.5%Triton X-100,处理细胞的作用是什么？,鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？,