核苷酸多态性SNP检测技术

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单核苷酸多态性检测技术,内容简介,1,SNP,概 念,2,SNP,特 点,3,SNP,检 测 技 术,4,实 验,SNP,的概念,单核苷酸多态性,(Single Nucleotide,Polymorphism,，,SNP),，指由于单个核苷酸碱基的,改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一,条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷,酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即,SNP,。,它包括单碱基的转换,颠换、 插入及缺失等形式,SNP,在基因组内的形式,:,一是遍布于基因组的大量单碱基变异,;,二是分布在基因编码区,(coding region) ,称其,为,cSNP,，属功能性突变。,SNP,在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的：,（,1,）,非转录序列,要多于,转录序列,（,2,）在转录区,非同义突变,的频率,比,其他方式突变,的频率低得多。,SNP,的特点,在遗传学分析中, SNP,作为一类遗传标记得以广泛,应用,主要源于这几个特点,:,（,1,）密度高,SNP,在人类基因组的平均密度估计,为,11000,bp,在整个基因组的分布达,310,6,个,遗传距离为,2,3cM ,密度比微卫星标记更高,可以,在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标,记。,（,2,）富有代表性,某些位于基因内部的,SNP,有可,能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此,它们可能代,表疾病遗传机理中的某些作用因素。,SNP,的特点,（,3,）遗传稳定性,与微卫星等重复序列多态性标,记相比, SNP,具有更高的遗传稳定性。,（,4,）易实现分析的自动化,SNP,标记在人群中,只有两种等位型,(allele),。这样在检测时只需一个,“,+ - ”,或,“,全,无,”,的方式，而无须象检测限制性片,段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测,量，这使得基于,SNP,的检测分析方法易实现自动,化。,一、,SNPs,经典检测方法,一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如,:,1 .,限制性片段长度多态性法,PCR- RFLP ;,2 .,单链构象多态性法,PCR- SSCP ;,3 .,变性梯度凝胶电泳,(,dena,t,ur,i,ng,gradient gel,eletrophoresi,s DGGE );,4 .,等位基因特异性,PCR ( allele specific PCR, ASPCR ),等等,PCR-RFLP,方法,原理：,利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，,用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一,DNA,片,断，如果存在,SNP,位点，酶切片断的长度和数量则会,出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否,SNP,位,点。,特点：,该技术应用的前提是,SNP,的位点必须含有该,限制内切酶的识别位点，它是,SNP,筛查中最经典的,方法之一,.,PCR-RFLP,原理图,单链构象多态性,(SSCP),原理：,单链,DNA,在中性条件下会形成二级结构，不同的,二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖,于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导,致在凝胶上迁移速度的改变。,在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链,DNA,和,RNA,分,子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上,的迁移速率不同，出现不同的条带，检测,SNP,。,特点：,由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。,变性梯度凝胶电泳（,DGGE,）,原理：,是利用长度相同的双链,DNA,片段解链温,度不同的原理,通过梯度变性胶将,DNA,片段分开,的电泳技术。,电泳开始时,DNA,在胶中的迁移速率仅与分,子大小有关,而一旦,DNA,泳动到某一点时,即到,达该,DNA,变性浓度位置时,使得,DNA,双链开始,分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电,场力平衡时, DNA,片段在凝胶中基本停止迁移。,由于不同的,DNA,片段的碱基组成有差异,使得其,变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条,带。,等位基因特异,PCR ( AS-PCR),原理：,根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特,异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) ,另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS,-,PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引,物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没,有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增,产物的有无,从而确定基因型的 SNP。,SNPs,高通量的检测方法,另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通,量、 自动化程度较高的检测,SNPs,的方法,较为常用,的有,:,1 . DNA,测序法,;,2 . DNA,芯片检测,;,3 .,飞行质谱仪,(MALDI- TOFMS ),检测,;,4 .,变性高效液相色谱,( DH PLC ),法等等,DNA,测序法,直接测序是最容易实施的,SNP,检测方法。,原理,:,通过对不同个体同一基因或基因片段进行测,序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检,出率可达,100%,。,特点：,可以得到,SNP,的类型及其准确位置等,SNP,分,型所需要的重要参数。,基因芯片技术,(,Genechips,),原理,:,是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的,载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好,的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出,待测序列的碱基类别。,特点：,基因芯片具有信息量大和自动化程度高的,突出优点。但它也存在若干问题: 芯片造价高昂, 所,需设备贵重, 不利于普及应用。,MALDI-TOF,原理：,是将变性的单链,PCR,产物通过与硅芯片上,的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基,不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基,的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测,SNP,。,变性高效液相色谱,( DHPLC),原理：,目标核酸片段,PCR,扩增，部分加热变性后，含有突变,碱基的,DNA,序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异,源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同,源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来,从而达到分离的目的。,SNPs,的有无最终表现为色谱峰的峰,形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的,碱基。,特点：,使用高效液相色谱检测,SNPs,具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知,SNPs,的准确率可达,95%,以上。但,DHPLC,检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。,MassARRAY,SNP,分型的方法多种多样，,MassARRAY,分子量阵列技术,是,Sequenom,公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过,引物延伸或切割反应,与灵敏、可靠的,MALDITOF,质谱,技术相,结合，实现基因分型检测。,基于,MassARRAY,分子量阵列平台的,iPLEX GOLD,技术,可以设计最高多达,40,重,PCR,反应和基因型检测,，实验设计非,常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对,全基因组研究,发,现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的,情况。,MassARRAY,技术原理,:,先通过,PCR,扩增目标序列，然后加入,SNP,序列,特异延伸引物，在,SNP,位点上，延伸,1,个碱基。将,制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的,真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离,子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过,检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分,析物的精确分子量，从而,检测出,SNP,位点信息。,MassARRAY,技术原理,:,MassEXTEND,单碱基延伸反应，紧挨,SNP,位点设计一段探针，在反应体系中以,ddNTP,替代,dNTP,，使探针仅在,SNP,位点处延伸一个碱基即终止。根据,SNP,位点的不同，探针将结合不同的,ddNTP,，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现,SNP,分型的目的。,MassARRAY,技术流程：,应用：,1.,确定基因多态性和疾病的关系,2.,解释个体间的表型差异对疾病的易感程度,3.,对未来疾病做出诊断,4.,研究不同基因型个体对药物反应的差异，指导药物开发及临床合理用药,5.,个体间,SNP,千差万别，通过,SNP,检测等技术进行法医鉴定及个体识别,优势,（,1,）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一,分子量，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低；,（,2,）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何,pmol,级别的物质都能被检测出来；,（,3,）通量高：几秒就能检测完一个反应孔；,（,4,）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规,PCR,仪器；,（,5,）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应；,（,6,）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（,3,条引物总长,80bp,左右），此外在一个反应孔内能完成,4,个或更多的反应，即通常所说的,4,重反应；,（,7,）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。,（,8,）质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。,