日本某公司液相色谱基础知识

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,HPLC Business Dept,Shimadzu Corporation,液相色谱基,础,础知识,一,、,、,色,色,谱,谱,起,起,源,源,石油醚,碳酸钙颗粒,色素,色谱,组分,液,相,相,色,色,谱,谱,：,：,以,以,液,液,体,体,作,作,为,为,流,流,动,动,相,相,的,的,色,色,谱,谱,分,分,离,离,方,方,法,法,适,用,用,于,于,高,高,沸,沸,点,点,、,、,大,大,分,分,子,子,、,、,强,强,极,极,性,性,和,和,热,热,稳,稳,定,定,性,性,差,差,的,的,化,化,合,合,物,物,的,的,分,分,析,析,流,动,动,相,相,具,具,有,有,运,运,载,载,样,样,品,品,分,分,子,子,和,和,选,选,择,择,性,性,分,分,离,离,的,的,双,双,重,重,作,作,用,用,气,相,相,色,色,谱,谱,：,：,以,以,气,气,体,体,作,作,为,为,流,流,动,动,相,相,的,的,色,色,谱,谱,分,分,离,离,方,方,法,法,适,用,用,于,于,沸,沸,点,点,较,较,低,低,、,、,热,热,稳,稳,定,定,性,性,好,好,的,的,中,中,小,小,分,分,子,子,化,化,合,合,物,物,的,的,分,分,析,析,流,动,动,相,相,只,只,起,起,运,运,载,载,样,样,品,品,分,分,子,子,的,的,能,能,力,力,液,相,相,色,色,谱,谱,基,基,础,础,知,知,识,识,HPLC,的,分,分,离,离,类,类,型,型,正,相,相,色,色,谱,谱,(NP-HPLC),反,相,相,色,色,谱,谱,(RP-HPLC),反,相,相,离,离,子,子,对,对,色,色,谱,谱,(RPIC),离,子,子,交,交,换,换,色,色,谱,谱,(IEC),空,间,间,排,排,阻,阻,色,色,谱,谱,(SEC),手,性,性,化,化,合,合,物,物,分,分,离,离,模,模,式,式,(Chiralseparationmode),液,相,相,色,色,谱,谱,按,按,两,两,相,相,极,极,性,性,不,不,同,同,分,分,为,为,:,正,相,相,色,色,谱,谱,反,相,相,色,色,谱,谱,化,合,合,物,物,保,保,留,留,时,时,间,间,随,随,流,流,动,动,相,相,配,配,比,比,的,的,变,变,化,化,不,同,同,极,极,性,性,的,的,化,化,合,合,物,物,出,出,峰,峰,顺,顺,序,序,正,相,相,HPLC,色,谱,谱,柱,柱,硅,胶,胶,型,型,氰,基,基,型,型,氨,基,基,型,型,糖,类,类,分,分,析,析,二,醇,醇,基,基,型,型,蛋,蛋,白,白,质,质,分,分,析,析,Silicagel,Si,Si,-Si-CH2CH2CH2,CN,-Si-CH2CH2CH2,NH2,-Si-CH2CH2CH2OCH,(OH),-CH2,(OH),ModifiedSi,反,相,相,HPLC,色,色,谱,谱,柱,柱,C18(ODS)type,C8(octyl)type,C4(butyl)type,Phenyltype,TMStype,Cyanotype,-Si-C,18,H,37,Si,Non-polarproperty,色,谱,谱,柱,柱,:,非,非,极,极,性,性,溶,剂,剂,:,极,极,性,性,水,/,甲,甲,醇,醇/,乙,乙,腈,腈,反,相,相,色,色,谱,谱,液,相,相,色,色,谱,谱,流,流,程,程,图,图,输,液,液,泵,泵,进,样,样,器,器,色,谱,谱,柱,柱,柱,温,温,箱,箱,检,测,测,器,器,溶,剂,剂,数,据,据,处,处,理,理,流,动,动,相,相,流,动,动,相,相,选,选,择,择,注,注,意,意,事,事,项,项,：,：,纯,度,度,：,：,采,采,用,用,“,“,HPLC,”,”,级,溶,溶,剂,剂,避,免,免,使,使,用,用,会,会,引,引,起,起,柱,柱,效,效,损,损,失,失,或,或,保,保,留,留,特,特,性,性,变,变,化,化,的,的,溶,溶,剂,剂,对,试,试,样,样,有,有,适,适,宜,宜,的,的,溶,溶,解,解,度,度,溶,剂,剂,粘,粘,度,度,要,要,小,小,与,检,检,测,测,器,器,相,相,匹,匹,配,配,流,动,动,相,相,配,配,制,制,时,时,的,的,顺,顺,序,序,溶,剂,剂,等,等,级,级,水,的,的,等,等,级,级,纯,化,化,水,水,蒸,馏,馏,水,水,去,离,离,子,子,水,水,波,长,长,(nm),纯,化,化,水,水,去,离,离,子,子,水,水,因,为,为,不,不,纯,纯,物,物,的,的,存,存,在,在,，,，,去,去,离,离,子,子,的,的,吸,吸,光,光,率,率,较,较,高,高,纯化水中去,除,除了无机和,有,有机的污染,物,物,吸光率,水,/ MeOH,梯度,ODS,柱,鬼峰,Gradient Curve,1 ml/min,0-100% MeOH,over10 mins and hold for,15 mins.,溶 剂,等,等 级,鬼峰的出现,溶 剂,等,等 级,溶剂的等级,HPLC,级,优级纯,分析纯,都经过蒸馏,和,和,0.45um,的过滤,(,除纤维毛,未溶解的机,械,械颗粒,),优级纯的纯,度,度比分析纯,大,大,但里面含有,防,防腐剂和抗,氧,氧化剂,HPLC,级经过,0.22um,的过滤,且除去有紫,外,外吸收的杂,质,质,微量分析、,梯,梯度洗脱,甲醇,乙,乙睛,正,正,己,己烷,分析纯级和,HPLC,级溶,剂,剂的,吸,吸光,度,度比,较,较图,溶,剂,剂,等,等,级,级,溶剂,前,前处,理,理,过滤,：,：,0.45um,或更,小,小孔,径,径滤,膜,膜,目的,：,：除,去,去溶,剂,剂中,的,的微,小,小颗,粒,粒，,避,避免,堵,堵塞,色,色谱,柱,柱，,尤,尤其,是,是使,用,用无,机,机盐,配,配制,的,的缓,冲,冲液,。,。,过滤,膜,膜种,类,类,水系,过,过滤,膜,膜,有机,系,系过,滤,滤膜,30mm,内径,：,：,适用,于,于大,进,进样,量,量的,过,过滤,，,，由,0.22,m,和,0.45,m,两种,规,规格,材料,有,有纤,维,维素,醋酸,纤,纤维,聚四,氟,氟乙,烯,烯。,处,处理,样,样品,体,体积,少,少于,50,l,。,13mm,内径,：,：,适用,于,于范,围,围广,的,的过,滤,滤，,由,由,0.22,m,和,0.45,m,两种,规,规格,材料,为,为纤,维,维素,。,。,3mm,内径,：,：,适用,于,于小,进,进样,量,量的,过,过滤,，,，由,0.22,m,和,0.45,m,两种,规,规格,。,。处,理,理样,品,品体,积,积为,7,l,。,样品,过,过滤,头,头的,类,类型,：,：,滤膜,类,类型,：,聚四,氟,氟乙,烯,烯滤,膜,膜：,适用,于,于所,有,有溶,剂,剂，,酸,酸和,盐,盐，,并,并无,任,任何,可,可溶,物,物。,醋酸,纤,纤维,滤,滤膜：,不适,用,用于,有,有机,溶,溶剂,，,，特,别,别适,用,用于,水,水基,溶,溶液,，,，推,荐,荐用,于,于蛋,白,白质,和,和其,相,相关,样,样品,。,。,尼龙,66,滤膜：,适用,于,于绝,大,大多,数,数有,机,机溶,剂,剂和,水,水溶,液,液，,可,可用,于,于强,酸,酸,70%,乙醇,、,、二,氯,氯甲,烷,烷、,不,不适,用,用于,二,二甲,基,基甲,酰,酰胺,。,。,再生,纤,纤维,素,素滤,膜,膜：,具有,蛋,蛋白,吸,吸收,低,低，,同,同样,适,适用,水,水溶,性,性样,品,品和,有,有机,溶,溶剂,。,。,溶剂,前,前处,理,理,脱气,目的,：,：除,去,去流,动,动相,中,中溶,解,解或,因,因混,合,合而,产,产生,的,的气,泡,泡,一般,混,混合,溶,溶剂,中,中能,容,容纳,的,的空,气,气量,往,往往,要,要比,单,单个,溶,溶剂,所,所能,容,容纳,的,的空,气,气总,量,量要,小,小,气泡,对,对测,定,定的,影,影响,：,：,1,）柱,压,压波,动,动，,流,流量,偏,偏小,2,）基,线,线波,动,动,返回,流路,中,中形,成,成气,泡,泡引,起,起的,问,问题,改变,保,保留,时,时间,和,和峰,面,面积,流动,相,相中,形,形成,气,气泡,对,对液,流,流的,不,不良,影,影响,泵中,形,形成,气,气泡,使,使液,流,流波,动,动,峰变,形,形,柱中,气,气泡,形,形成,和,和累,积,积使,流,流动,相,相绕,流,流,尖峰,或,或锯,齿,齿状,噪,噪声,检测,池,池中,气,气泡,形,形成,和,和累,积,积产,生,生基,线,线噪,声,声,输液,泵,泵,输液,泵,泵控,制,制方,式,式：,恒流,控,控制,恒压,控,控制,输液,泵,泵类,型,型：,注射,泵,泵,柱塞,往,往复,泵,泵,隔膜,泵,泵,柱塞,往,往复,泵,泵,单向阀,马达和凸轮,柱塞杆,柱塞杆密封圈,泵头,10 -100,uL,柱塞,往,往复,泵,泵,优点,压力,脉,脉动,小,小,易于,更,更换,溶,溶剂,缺点,需要,更,更换,柱,柱塞,杆,杆密,封,封圈,岛津,VP,系列,输,输液,泵,泵,目的,单,单元,流,流,速,速范围,特,特性和应,用,用,分析,LC-10AD,VP,0.001-9.999,无脉动，,适,适于,半,半微量,LC,和,LC-MS,LC-10AT,VP,0.001-9.999,非凡的耐,用,用性，,适于常量,分,分析,*,所有单元,都,都既可做,高,高压梯度,又,又可做低,压,压梯度,等度洗脱,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,单一或混合溶剂,梯度洗脱,A,泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,B,泵,A,B,时间,B,浓度,分析时间,长,长,分离度差,MeOH/ H2O =6 /4,MeOH/ H2O =8 /2,(,column :ODStype ),等度洗脱,95%,30%,MeOH,浓度,梯度洗脱,梯度洗脱,：,：,优点：可,提,提高分离,度,度、缩短,分,分离时间,、,、降低最,小,小检测量,和,和提高分,离,离精度,注意事项,：,：,溶剂的纯,度,度要高，,否,否则梯度,洗,洗脱的重,现,现性差,梯度混合,的,的溶剂互,溶,溶性要好,梯度洗脱,应,应使用对,流,流动相组,成,成变化不,敏,敏感的选,择,择性检测,器,器（如紫,外,外吸收检,测,测器或荧,光,光检测器,）,），而不,能,能使用对,流,流动相组,成,成变化敏,感,感的通用,型,型检测器,（,（如示差,折,折光检测,器,器）,混合器,低压梯度,比,比例阀,高压梯度,低压梯度,脱气机,高压,/,低压梯度,系,系统,返回,高压梯度,系,系统,梯度准确,度,度好,系统复杂(需两,台,台或三台,泵,泵),低压梯度,系,系统,系统简单,需在线脱,气,气机,存在时间,滞,滞后效应,高压,/,低压梯度,系,系统,进样器,自动进样,器,器,手动进样,器,器,原理：（,六,六通阀）,注入方式,：,：,1,）全量注,入,入,2,）部分注,入,入,返回,手动进样,器,器的原理,图,图,装填状态,进样状态,返回,进样体积,检测器响,应,应值,定量管体,积,积的一半,3倍定量,管,管体积,全量注入,部分注入,进样体积,与,与响应值,关,关系,返回,柱温箱,分析结果,重,重现性好,提高柱效,降低柱压,保证检测,稳,稳定性,柱温控制,的,的优点：,色谱柱,1）柱压,低,低于150kgf/cm,2,（,15cm,色谱柱）,2,）,柱温在40左右,，,，最高使,用,用温度为50,3）流动,相,相PH使,用,用范围为27.5,返回,ODS,柱的使用,注,注意点：,流动相注,意,意点,离子对试,剂,剂的使用,具有缓冲,盐,盐流动相,的,的使用,分,分析结,束,束及开始,流动相平,衡,衡 加,快,快平衡时,间,间,异丙醇的,使,使用,LC,检测器,紫外可,见,见检测,器,器（,UV/VIS,）,二极管,阵,阵列检,测,测器（,PDA,）,示差检,测,测器（,RID,）,电导检,测,测器（,CDD,）,荧光检,测,测器（,RF,）,电化学,检,检测器,（,（,L-ECD,）,质谱检,测,测器（,MS,）,蒸发光,散,散射检,测,测器（,ELSD,）,紫外可,见,见检测,器,器,原理：,基,基于被,分,分析组,分,分对特,定,定波长,紫,紫外光,的,的选择,性,性吸收,定量基,础,础：,Lambert-Beer,定律，,A,KCL,优点：,1,）对温,度,度和流,速,速变化,不,不敏感,2,）可用,于,于梯度,分,分析,缺点：,仅,仅适用,于,于测定,有,有紫外,吸,吸收的,物,物质,紫外可,见,见检测,器,器,样品池,参比池,光电管,光电管,E,in,E,in,E,in,光栅,D2 / W,灯,l,E,out,紫外可,见,见检测,器,器,岛津,VP,系列紫,外,外检测,器,器功能,1）设,定,定时间,程,程序（,波,波长切,换,换等）,2）双,波,波长检,测,测,3）比,例,例色谱,，,，初步,判,判断峰,的,的纯度,4）停,泵,泵扫描,，,，确定,组,组分最,大,大吸收,波,波长,NEXT,波长切,换,换,返回,双波长,检,检测,返回,比例色,谱,谱,280,nm,220,nm,ratio,280/220,返回,波长扫,描,描,返回,二极管,阵,阵列检,测,测器（,SPD,M10AVP,）,二十一,世,世纪标,准,准紫外,检,检测器,色谱信,息,息：,保留时,间,间,常,常,规,规紫外,检,检测器,紫外光,谱,谱,二,二,极,极管阵,列,列检测,器,器,样品池,二极管,阵,阵列（512,个,个单元,）,）,光栅,D2/ W,灯,每一单,元,元可检,测,测一个,波长下,的,的吸光,度,度,二极管,阵,阵列检,测,测器,三维谱,图,图,时间,波长,吸光度,色谱,光谱,二极管,阵,阵列检,测,测器的,优,优点,1,）采集,三,三维谱,图,图,2,）峰纯,度,度检验,3,）光谱,库,库检索,NEXT,峰纯度,检,检验（,3,点光谱,图,图比较,）,）,Initial detection,point,Finaldetection,point,T1,T3,T2,peak top,upslope,down slope,1/2,1/3,乙酰水,杨,杨酸,下降点,上升点, 顶,点,点,峰纯度,检,检验（,3,点光谱,图,图比较,）,）,返回,光谱库,检,检索,返回,检测器,原理：,连,连续测,定,定流通,池,池中溶,液,液折射,率,率变化,以,以测定,试样各,组,组分浓,度,度。,优点：,通,通用型,检,检测器,缺点：,1,）对温,度,度和压,力,力变化,敏,敏感,2,）不能,用,用于梯,度,度分析,示差折,光,光检测,器,器,返回,糖的色,谱,谱图,Analytical Conditions,Column:Shim-packCLC-NH2,Mobilephase:Acetonitrile/water=7 /3,Flow rate:1.0mL/min,Temperature: Ambient,Peaks,1.,甘,甘油,2.,木,木糖,3.,果,果糖,4.,葡,葡萄糖,5.,蔗,蔗糖,6.,甘,甘露糖,7.,乳,乳糖,荧光检,测,测器,原理,:,基于被,分,分析组,分,分发射,的,的荧光,强,强度进,行,行检测,缺点,:,仅适用,于,于测定,可,可产生,荧,荧光的,物,物质,优点,: 1),灵敏度,极,极高,是最灵,敏,敏的检,测,测器之,一,一,2),选择性,好,好,3),对温度,和,和流速,不,不敏感,可用于,梯,梯度洗,脱,脱,可检测,物,物质,:,多环芳,烃,烃,霉菌毒,素,素,酪氨酸,色氨酸,儿茶酚,氨,氨等,(,具有对,称,称共轭,体,体系,),数据处,理,理,岛津液,相,相色谱,数,数据处,理,理单元,：,：,LC-Solution,色谱工,作,作站,CLASS-VP色,谱,谱工作,站,站,CR7A色,谱,谱数据,处,处理机,CR8A色,谱,谱数据,处,处理机,返回,