功能蛋白质组学研究方法

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,功能蛋白质组学研究方法,功能蛋白质组学,是指对蛋白质间、蛋白质,DNA/RNA,间的相互作用的研究。,以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容，,由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。,蛋白质芯片技术,噬菌体展示技术,酵母双杂交系统,蛋白质芯片,蛋白质芯片,是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。,蛋白质芯片反应结果的检测依据被检测蛋白样品的标记种类来选择不同的检测设备。,荧光标记,是芯片息采集中使用最多也是最成功的报告标志。杂交反后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以进行分析，将荧光信号转成数据，即可获得有关生物信息。,蛋白质芯片分类,根据,固定介质,的不同,可以分为两大类,:,化学型蛋白质芯片（,SELDI-TOF-MS,蛋白质芯片）,生物型蛋白质芯片（如抗体、受体、配体等）；,根据,片基材料,的不同可以分为：,膜芯片、玻璃芯片和液相芯片等。,目前常用蛋白质芯片有：,1.,SELDI-TOF-MS,蛋白质芯片,2.,抗体芯片,3.,靶蛋白质芯片,4.,液相蛋白质芯片,SELDI-TOF-MS,蛋白质芯片,表面加强激光解吸电离,-,飞行时间质谱,(,surface enhanced laser desorption/ionization time of flight-mass spectrometry,，,SELDI-TOF-MS,）,蛋白质芯片由部分组成：蛋白质芯片、阅读器和分析软件。,蛋白质芯片是核心部分，芯片上固定的介质可以是阴离子、阳离子、疏水性、亲水性、金属等，根据蛋白质的化学特性而有选择性地捕获特异的蛋白质。,技术的基本原理,:,将待测样品滴到芯片表面,(,血清、尿液、分泌液、细胞裂解液等,),，通过亲合作用样品中的某些蛋白质被吸附到芯片的固相基质表面上，用缓冲液洗去芯片上的杂质蛋白和其他污染物，然后在芯片上加入能量吸收分子（,energy,absorbing molecular,EAM,），芯片干燥后，在真空管中用激光轰击，蛋白质在吸收能量后被解析发生离子化，,在电场力作用下脱离芯片表面，,被离子检测器所检测。检测结果经过软件分析处理后，,可绘制出质谱图，显示相关蛋白质的分子量、含量等信息。,抗体芯片,抗体芯片主要研究在不同生理或病理状态下蛋白质水平的量变。微型化、集成化、高通量化是抗体芯片重要特点。,芯片上排列了许多已知蛋白质的单克隆抗体，这些单克隆抗体对应的蛋白质（抗原）都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡等广泛的领域。,抗体芯片检测的结果不是蛋白质的绝对含量而是目的蛋白质在两个样品之间的相对峰度。,靶蛋白质芯片,主要用于蛋白质相互作用研究、蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。,靶蛋白质的获得：,1.,化学合成；,2.,基因工程表达蛋白质并进行纯化点样制作芯片；,3.,将活的生物体,(,如细菌、酵母等,),在芯片上原位表,达蛋白质（,living,芯片）。,4,.,将核酸固定在芯片介质中，然后利用不依赖细胞,的体外蛋白表达系统，在原位合成靶蛋白,。,液相蛋白质芯片,是一种新型的、高度灵活的多元蛋白质研究平台，可以适用于蛋白质组研究、临床研究和药物研究中的各种蛋白质分析。,液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相蛋白质芯片系统。在液相系统中，为了区分不同的探针，在球形基质的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种红色分类荧光的比例不同,(,色彩编号,),，区分不同的探针。,可同时固定各种蛋白质、多肽、核酸等生物分子，,可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测。,噬菌体展示技术,自,1985,年,Smith G P,等创建噬菌体展示技术，其原理是：以经过改建的噬菌体为载体，把外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因,P,区或,P,区，从而使表达的外源肽或蛋白质展示在噬菌体的表面，并使表达产物保持良好的空间构象。进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的多肽,/,蛋白质。,这一技术有效地实现了基因型和表型的体外转换，即在二者之间架起了联结的桥梁，使得研究者完全可以在分子克隆的基础上，有效地实现蛋白质构象的体外控制，从而可以在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。,Navagen,公司用,T7,噬菌体构建的各种,cDNA,表达文库，将外源基因序列插入到编码,T7,噬菌体包膜蛋白基因中，插入片段基因长度可在,300 bp,3 000 bp,之间，所表达的多肽或蛋白质以与噬菌体包膜蛋白融合的形式展示在噬菌体表面，大小在,50,个,1 200,个氨基酸。,T7,噬菌体展示文库可以展示相当部分表达的蛋白质，甚至可以保持蛋白的一定构象。因此，该系统最大程度地再现了细胞内的真实情况，所筛选出的结合蛋白与自然状态较为接近。目前已被成功应用于蛋白质,-,蛋白质、抗原,-,抗体以及,DNA-,蛋白质之间作用的研究，为功能基因组学的研究提供了一种新的方法。,cDNA,库是在噬菌体衣壳蛋白的基因中插入从某些组织或细胞中抽提出来的,mRNA,的互补,DNA,片段，从而表达该组织或细胞的各种蛋白于噬菌体的表面。,如：抗体库的构建,表达载体噬菌粒,pCANTAB 5E,噬菌体展示技术的应用,1.,与蛋白质相互作用的研究,有研究利用,T7,噬菌体展示筛选系统，以丝裂原活化蛋白激酶（,MAPK,）信号转导通路中,p38,作为靶蛋白，筛选了与其有结合关系的多肽或蛋白，得到了,46,个编码蛋白的序列，在这些蛋白中有激酶、转录因子、细胞骨架相关蛋白和离子通道相关蛋白等。,2.,在筛选和制备多肽药物方面的研究及应用,随机噬菌体展示多肽文库：,一组随机编码序列或基因群插入噬菌体载体进行表达及展示时,就形成噬菌体展示文库，在文库中,每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链,不同噬菌体粒子展示不同序列的外源肽链。用一定功能的靶分子筛选，可以简便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋白，这些肽段可以作为侯选药物进行开发。,3,在疾病的治疗和致病机理方面的研究,有研究以,HCV,非结构蛋白,NS4A,作为固相靶分子，用,T7,噬菌体表面展示的人肝细胞,cDNA,文库进行,5,轮筛选后，确定了与,HCV,非结构蛋白,NS4A,结合的是肝细胞蛋白丝裂原激活蛋白激酶（,MAPK,）激活蛋白激酶,5,（,MAPKAPK5,），为进一步研究,HCV,的致病机制奠定了基础。,酵母双杂交系统,酵母双杂交技术由,Fields,等人于,1989,年提出。,该技术利用了酵母转录因子,GAL4,性质，,GAL4,包括两个彼此分离但功能上必需的结构域,一个是位于,N,端,1-174,位氨基酸残基区段的,DNA,结合,(DNA binding domain,DNA-BD),另一个是位于,C,端,768-881,位氨基酸残基区段的转录激活域,(Activation domain,AD,）。,DNA-BD,能够识别,GAL4,效应基因的上游激活序列,(Up stream activating sequence,UAS),并与之结合，而,AD,则通过与转录机制中的其他成分之间的作用,启动,UAS,下游的基因进行转录。,DNA-BD,和,AD,单独作用均不能激活转录反应,只有当二者在空间上充分接近并呈现完整的,GAL4,转录因子活性时,方可激活,UAS,下游启动。,该系统中转录激活的条件是,蛋白质作为一个整体,起作用。,分别经分子克隆技术在同一细胞中表达的,BD,和,AD,多肽不会彼此间发生作用，,BD,和,AD,分别可以同其他蛋白质,X,或,Y,结合形成融合蛋白,如果,X,，,Y,之间可以形成蛋白,-,蛋白复合物,使,GAL4,两个结构域重新构成,AD,和,BD,成为一体,就可以启动特异基因序列的转录。,GAL4,重建后激活转录模式图,BD,AD,X,Y,UAS,报告基因（,LacZ,）,一般地,将,BD-X,的融合蛋白称作,诱饵,(bait),X,往往是已知蛋白,AD-Y,称作,猎物,(prey),能显示诱饵和猎物相互作用的基因称,报告基因,通过对报告基因的检测,反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用。,作为一种分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的简便而有效的研究体系,酵母双杂交的最大的优点是不需要分离、纯化蛋白质,整个过程只是对核酸进行操作。,酵母双杂交系统,应用,它主要应用在以下几个方面,:,1.,用于验证通过其他方法发现的蛋白质之间是否有相互作用,;,2.,确定已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域,;,3.,筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的候选蛋白质。,酵母双杂交系统的局限性,1.,并非对所有蛋白质都适用,双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工,如糖基化,二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。另外,有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其它非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。,2.,假阳性的发生,假阳性分为两类：,一类是生物学上的假阳性,即蛋白质与蛋白质的相互作用在酵母细胞中发生,但是在其生物体细胞内并不发生相互作用，这主要是因为两种蛋白不同时表达或者二者根本不在同一组织中，这种假阳性,我们如果对所研究的蛋白质的生物学特性没有深入了解的话,是很难排除的。,另一类是技术上的假阳性,即由于双杂交技术上的局限而鉴定出的蛋白质与蛋白质间的相互作用。,包括筛库过程中自发升高的,BD-x,融合蛋白自我激活导致的假阳性，在,BD-x,融合蛋白不存在的情况下,AD-Y,融合蛋白单独激活报告基因，导致的假阳性,以及酵母中其他蛋白质作用引起的假阳性等。,因此，虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白质相互作用,但其中部分蛋白质在生理状态下可能不发生相互作用,双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性,这种可能性还必须经过其他实验验证,尤其要与生理功能研究相结合,否则可能会误入歧途。,酵母双杂交体系的新发展,传统酵母双杂交体系的改建,根据酵母的营养缺陷,发展了多重筛选机制,表达载体构建的改进,将蛋白的相互作用场所从核内移至细胞膜,哺乳动物细胞双杂交系统,三杂交系统的产生：用于研究蛋白和,RNA,间的相互作用。,