实验一叶绿体色素的提取分离及理化性质

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定,一. 实验原理,1.1 叶绿素： 主要包括叶绿素a和b,分子式: Chla C,55,H,72,O,5,N,4,Mg,Chlb C,55,H,70,O,6,N,4,Mg,结构式:,卟啉环化合物 四个吡咯环与四个=CH-组成一个大环,共轭双键形成一个大键,环中央有一个镁原子,卟啉环决定叶绿素颜色,也是吸收可见光,并以诱导共振方式传递光能的根本所在,叶醇尾是由四个异戊二烯单位组成的双萜,Chla 蓝绿色 Chlb 黄绿色,脂溶性: 难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、已醚、已烷等有机溶剂,卟啉环头部呈极性, 具亲水性; 叶醇尾部具亲脂性,皂化反应:,Chla、Chlb 是双羧酸的酯,一个羧基被甲基酯化 可发生皂化反应,另一个羧基被叶醇基酯化,COOCH,3,C,32,H,30,ON,4,Mg +2KOH,COOC,20,H,39,COOK,C,32,H,30,ON,4,Mg +CH,3,OH+C,20,H,39,OH,COOK,取代反应：卟啉环中的Mg,2+,可被H,2+,、Cu,2+,、Zn,2+,取代，被Cu,2+,、Zn,2+,取代后仍保持绿色,光学特性：,（1）,吸收光谱：,色素溶液随波长改变而发生光吸收变化的图谱,Chla Chlb的吸收光谱有二个强吸收峰,640660nm 红光部分 叶绿素特有,410470nm 蓝紫光部分 卟啉环化合物共有,（2）,荧光和磷光,荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。强度大，寿命短（10,-9,秒）,磷光： Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内放出暗红色的光。 寿命长（10,-2,秒10,-3,秒）,1.2 类胡萝卜素,类胡萝卜素 胡萝卜素 橙黄色 不溶于水,叶黄素 鲜黄色 溶于有机溶剂,分子式、,结构式：,胡萝卜素：C,40,H,56,有、三种同分异构体,叶黄素是胡萝卜素的衍生物，其两端的紫罗兰酮环第四位C上的H被OH取代，分子式为C,40,H,56,O,2,类胡萝卜素,吸收光谱,都在蓝紫光部分，所吸收的光能传递给叶绿素用于光合作用，保护叶绿素分子不被氧化或阳光破坏,1.3 类黄酮类,根据三碳桥的氧化程度可分为：,花色素苷,：呈现颜色。紫色锌化物、红色的碱盐、无色化合物,黄酮 防御伤害。 存在于花器官和绿叶中。,黄酮醇 紫外光保护剂，吸收UV-B，避免细胞受到伤害。,异黄酮 功能多样。鱼藤酮杀虫，植物防御素抑制微生物。,花色素苷分布广，溶解于细胞液中，与花、果、叶的颜色有关。,颜色受多因素影响：,B环上羟基和甲氧基数目,羟基数多，吸收光向长波迁移，颜色偏蓝,羟基被甲氧基替代，吸收光向短波迁移，颜色偏红,芳香酸对主要骨架的酯化,液泡中pH值 酸红碱蓝,营养状况 低温、缺氮、缺磷 促进化色素的形成和积累,不同花色素的取代基和颜色,花色素 3 4 5 颜色,花葵素 -H -OH -H 橙红,花青素 -OH -OH -H 紫红,花翠素 -OH -OH -OH 蓝紫,芍药素 -OCH,3,-OH -H 玫瑰红,甲花翠素 -OCH,3,-OH -OH 紫,二甲花翠素 -OCH,3,-OH -OCH,3,紫红,二. 试剂与材料,2.1 实验试剂：,石油醚（沸程6090）、丙酮、甲醇、氢氧化钾、石英砂、碳酸镁、氯化钠、醋酸铜。,2.2 仪器和器皿,：,分光光度计、台秤、剪刀、 研钵、移液管、漏斗、大试管、层析缸,2.3 材料：,新鲜菠菜叶片，不同颜色的花和果实。,三.实验操作,丙酮研磨提取叶绿素,过滤、洗研钵及残渣, ,2mL丙酮提取液 余下的色素提取液用石油醚萃取, ,加入6N HCl,纸层析,荧光 皂化反应 光破坏,（脱镁叶绿素） , 分离色素,Cu取代 ,扫描光谱 花色素实验,四. 结果与分析,对实验现象作好详细记录， 并加以解释,请对,皂化反应现象做出合理解释，而不是单单用反应方程式来表示,五. 注意事项,实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要远离火源。,研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研磨时四处飞溅。,过滤时不要使用滤纸而使用棉花，棉花塞在漏斗基部要松紧适当。,叶绿素要避光保存。,六. 思考题,6.1 叶绿素、荧光素酶以及绿色荧光蛋白都能产生荧光，它们的原理有什么不同？能量来源有何差异？,6.2 转GFP的植物在检测绿色荧光时为何没有看到叶绿素的红色荧光?若选择荧光标记绿色植物细胞,在选择荧光物质时应首先考虑什么问题?,6.3 如何判断呈橙黄色的花和果实中含的是类胡萝卜素还是花色素？,