手足口病的病原学及实验室检测

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,手足口病的病原学及实验室检测,陈立,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,国家脊灰实验室,2010-04-21,手足口病的病原,引起手足口病的病毒属于小,RNA,病毒科肠道病毒属，包括：,*柯萨奇病毒,A,组（,Coxasckievirus A,CVA,）的,2,、,4,、,5,、,7,、,9,、,10,、,16,型等,*,B,组（,Coxasckievirus B,CVB),的,1,、,2,、,3,、,4,、,5,型等；,*肠道病毒,71,型（,Human Enterovirus 71,EV71,）；,*埃可病毒（,Echovirus,ECHO,）等。,其中以,EV71,及,CVA16,型较为常见。,肠道病毒适合在湿、热的环境下生存与传播，,75%,酒精和,5%,来苏不能将其灭活，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感,；对紫外线和干燥敏感，各种氧化剂,(,高锰酸钾、漂白粉等,),、甲醛、碘酒以及,5630,分钟可以灭活病毒。病毒在,4,可存活,1,年，,-20,可长期保存，在外环境中可长期存活。,人肠道病毒感染的一般致病机制,进入途径,口腔,/,呼吸道,咽喉及下肠胃道,传播,扁桃体,、,深层淋巴结,、,肠道淋巴结,微病毒血症,先天性感染,神经系统,心,脏,肝脏,、,胰脏、,肾上腺,呼吸系统,皮肤及黏膜,病毒血症,神经系统,抗体产生,、,病毒血症消失,，,病毒感染症状改善,飞沫、接触、饮食,肌肉,流行病学,传染源,患者和隐性感染者,。发病前数天，感染者咽部与粪便就可检出病毒，通常以发病后一周内传染性最强。,传播途径：可经胃肠道（,粪,-,口途径,）传播，也可经呼吸道（飞沫、咳嗽、打喷嚏等）传播，亦可因接触患者口鼻分泌物、皮肤或粘膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播,流行：以,5,岁及以下儿童为主，尤以,3,岁及以下儿童发病率最高。一般,5-7,月为发病高峰,实验室诊断,临床诊断病例符合下列条件之一者，即可诊断为实验室确诊病例,自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子、脑脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本中,分离到人肠道病毒,（指包括,CVA16,和,EV71,等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）。,自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子等标本中,检测到,CVA16,或,EV71,特异性核酸，,或从脑脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本等标本中检测到人肠道病毒（指包括,CVA16,和,EV71,等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸。,实验室诊断,血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴度,1256,，或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有,4,倍或,4,倍以上的升高,病原学监测要求,各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监测，了解病原动态分布变化。,所有重症和死亡病例均需采样。此外，以县（区）为单位，每月最少需采集,5,例首次就诊的普通病例标本；当月县（区）病例总数少于,5,例时，全部采样。,以省（区、市）为单位,在手足口病流行年份中每年至少采集,20,对,EV71,和,10,对,CVA16,感染的手足口病患儿的双份血清,以阐明和分析,EV71,和,CVA16,感染后,IgG,和,IgM,抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。,以省（区、市）为单位，每月至少从手足口病病例中分离,10,株毒株并做血清型别鉴定，鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于,5,个工作日内报送至中国疾病预防控制中心。具备测序条件的省份，可开展,VP1,基因序列测定和分析,，进行基因定型，序列测定完成后将序列结果于,5,个工作日内报送至中国疾病预防控制中心；不具备测序条件者，将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定，中国疾病预防控制中心要于,28,个工作日内反馈基因定型结果。,31,个省级实验室,1,国家实验室,331,个地级实验室,肠道病毒分离物基因分型,血清流行病学检测,诊断方法建立,质量控制,对省级实验室提供技术支持,肠道病毒分离和鉴定,(PCR,ICA,PCR-RFLP,real time PCR,）,对地级实验室的质量控制,对地级实验室提供技术支持,RT-PCR,Real time PCR,采集标本,中国肠道病毒三级实验室网络,标本采集和检测,（,1,）,所有重症和死亡病例均要采集标本,，可以采集咽拭子、粪便或肛拭子、疱疹液、脑脊液、血清等，死亡病例还可采集脑、肺、肠淋巴结等组织标本。聚集性病例至少要采集,2,例病例标本开展病原学检测。,（,2,）,医疗机构负责样本采集,，疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集。,（,3,）疾病预防控制机构根据本地的技术能力，对采集的标本开展核酸检测、病毒分离；不具备技术条件时，及时送上级机构进行检测。,标本的选择,粪便标本、肛拭子（,3,日内,5-8g,）,咽拭子标本,(3,日内,维持液,),血清标本（发病,0-3,天，,14-30,天）,疱疹液（多个疱疹作为一个标本）,脑脊液标本,(,出现神经系统症状后,3,天内）,采集标本的种类、保存和运输,（一）粪便标本。采集病人发病,3,日内,的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集,量,5-8g/,份,，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，,4,暂存,12,小时内,送达实验室，,-20,以下低温冷冻保藏，,需长期保存的标本存于,-70,冰箱。,采集标本的种类、保存和运输,（二）咽拭子标本。采集病人发病,3,日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，,适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；,迅速将棉签放入装有,3-5ml,保存液（含,5%,牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的,15ml,外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。,4,暂存并在,12,小时内送达实验室，,-20,以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于,-70,冰箱。,采集标本的种类、保存和运输,（三）血清标本。,各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集,EV71,和,CVA16,感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（发病,0-7d,）和恢复期（发病,14-30d,）双份配对血清用于阐明和分析,EV71,和,CVA16,感染后,IgG,和,IgM,抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集,3-5ml,全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到,2ml,外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于,-20,以下冰箱中冷冻保存。,（四）疱疹液,在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时,采集多个疱疹作为一份标本,。先用,75%,的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有,3-5ml,保存液（含,5%,牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本,4,暂存立即（,12h,内）送达实验室，,20,以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于,70,冰箱。,（五）肛拭子标本,采集病人发病,3,日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有,3,5ml,保存液（含,5%,牛血清细胞维持液）的,15ml,外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。,（六）尸检标本,采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取,2-3,份约,5-10g,的组织，淋巴结,2,个，分别置于,15ml-50ml,无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。,（七）脑脊液标本。,出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后,3,天内，采集量为。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，,4,暂存立即,(12h,内,),送达实验室，,20,以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于,70,冰箱。但,EV71,感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到,EV71,病原。,标本运输和贮存注意事项,临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。,标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，,12,小时内送达实验室。,依照,人间传染的病原微生物名录,，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按,B,类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。,可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。,在送到省、地、市级,CDC,实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的,手足口病病例临床标本采样登记表,。,实验室检测,病毒分离,测定人双份血清标本的中和抗体滴度,逆转录,-,聚合酶链反应（,RT-PCR,）,Real-time RT-PCR,（,rRT-PCR,）,病毒分离,病毒分离细胞系：,RD,细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。,HEp-2,细胞，来源于人喉癌上皮细,粪便标本和肛拭子的处理：按“手足口病标本采集及检测技术方案”,疱疹液标本通常直接用于,RNA,提取或病毒分离。,脑脊液标本通常直接用于病毒分离,咽拭子标本的处理：按“手足口病标本采集及检测技术方案”,咽拭子处理,（病毒分离用）,咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少,40,下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在,4,条件下，,10000 rpm,离心,20min,，用上清接种到细胞上或直接提取,RNA,。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。,病毒分离结果解释,RD,细胞支持,HFMD,的主要病原体,CVA16,和,EV71,等多种肠道病毒的复制，,CVA16,和,EV71,均能在,RD,细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（,CPE,），,表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。,但相同滴度的,CVA16,和,EV71,在,RD,细胞中生长的速度不同，,EV71,的生长速度要快于,CVA16,，表现为,EV71,感染,RD,细胞后出现,CPE,的时间比,CVA16,早，,EV71,接种细胞后出现,CPE,很快，但,CVA16,一般要经过,2,次以上传代才出现明显的,CPE,。,若在使用,RD,细胞分离的同时再增加,HEp-2,细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致,HFMD,的病原体，如一些柯萨奇,B,组病毒）。但,CVA16,和,EV71,在,HEp-2,细胞中均不繁殖。,测定人双份血清标本的中和抗体滴度,比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验,通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度,4,倍或,4,倍以上增高证明病毒感染。,肠道病毒隐性感染也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些,中和试验结果判定,如果恢复期血清较急性期血清,EV71,或,CVA16,中和抗体滴度出现,4,倍或,4,倍以上增高即可确诊；,如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现,4,倍或,4,倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；,如果单份血清中和抗体滴度大于,1:256,也有诊断意义，血清中和抗体滴度为,1:128,判定为可疑阳性。,逆转录,-,聚合酶链反应（,RT-PCR,）的标本处理,粪便标本：采用氯仿进行处理后提取核酸。,肛拭子,/,咽拭子标本：咽拭子要在标本保存液中充分搅动，然后在,4,